Projecto de Procedimento de Ensaio Quantificação de ADN Mitocondrial por

I. Objectivo

Este método consiste na aplicação da técnica de PCR em tempo real para a quantificação de ADN mitocondrial humano presente numa amostra, pela análise da variação de fluorescência em cada ciclo.

II. Âmbito

Este ensaio é usado para a amplificação e detecção de um fragmento de 113 pares de bases, da região hipervariável I (HVI) do genoma mitocondrial, usando tecnologia Taqman®_.

III. Fundamentos teóricos do método

Este método é baseado na detecção da actividade exonucleotídica 5’-3’ da Taq ADN polimerase, tendo como base a tecnologia Taqman®. Esta técnica permite monitorizar a quantidade de ADN amplificado em tempo real, à medida que se este acumula em cada ciclo de amplificação. Assim, ao longo da reacção a emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumenta em proporção directa da quantidade de produto amplificado. Deste modo, em cada ciclo, é registado o valor da fluorescência que irá ser utilizado para calcular a quantidade de ADN amplificado. Na tecnologia TaqMan® são utilizados dois primers e uma sonda que detectam uma sequência específica do ADN. Esta sonda apresenta numa extremidade um fluorocromo repórter e na extremidade oposta um quencher e liga- se na região intermédia de ligação dos primers. Quando a sonda está intacta, o

quencher absorve a fluorescência do repórter, impedindo a detecção da

fluorescência deste. Após a sonda hibridar com a sua sequência específica, esta é hidrolisada pela enzima que, assim, separa o quencher da molécula repórter, durante a fase de extensão. Esta separação vai resultar num aumento exponencial da fluorescência da molécula repórter, que só ocorre se a sonda hibridar correctamente e for feita a amplificação da sequência alvo, neste caso um fragmento de 113 pares de bases, da região hipervariável I (HVI) do genoma mitocondrial.

IV. Equipamento

As amostras são amplificadas, quantificadas e analisadas num equipamento de PCR em tempo real - ABI Prism® 7000 Sequence Detection System, que inclui um

software específico ABI Prism® 7000 SDS (Applied Biosystems).

V. Componentes e condições de armazenamento Para a realização deste ensaio é necessário:

- Taqman Universal PCR Master Mix (armazenado de 2 a 8 °C). - Dois primers (armazenados de −15 a −25 °C):

L15997/A1F: CAC CAT TAG CAC CCA AAG CT H16071/A1R: ACA TAG CGG TTG TTG ATG GG - Sonda MGB (armazenada de −15 a −25 °C):

- VIC – GAA GCA GAT TTG GGT AC - MGB

- Solução de ADN Padrão (Linha celular Raji- ABI): 200 ng/µl (DNA nuclear)

VI. Procedimento

a) Preparação das soluções padrão

1. Seleccionar as amostras a analisar e elaborar uma tabela correspondente à placa de 96 poços, onde as amostras vão ser colocadas, elaborando concomitantemente um documento no Software SDS (Applied Biosystems), de acordo com o protocolo específico.

2. Preparar uma série de tubos, numerados de STD1 a STD8, que irão servir para a preparação das diluições da amostra padrão, necessárias para a obtenção da curva padrão.

Nota: É conveniente preparar, pelo menos, três séries de oito diluições da amostras padrão de ADN, para que estas existam sejam realizadas em triplicado, e é aconselhável usar, pelo menos, um volume final de 10µl para as diluições, de modo a evitar erros de pipetagem.

3. Nas tabelas seguintes, estão indicadas as concentrações de ADN que devem ser utilizadas em cada um dos tubos, valores esses que variam entre 10 e 0,001 ng/µl (ADN nuclear), bem como o respectivo volume e de água Milli-Q a adicionar em cada um desses tubos, de modo a obter a concentração pretendida.

Tabela 1 – Preparação das diluições seriadas para obtenção de soluções padrão.

* - Solução stock de ADN genómico, com concentração de 200ng/µl.

STD 1 STD 2 STD 3 STD 4 STD 5 STD 6 STD 7 STD 8 Quantidade ADN 2µl Sol. stock

(200ng/µl)* STD1 20µl STD2 8µl STD3 20µl STD4 8µl STD5 20µl STD6 8µl STD7 4µl

Quantidade

Água Milli-Q 38µl 20µl 32µl 20µl 32µl 20µl 32µl 36µl

Tabela 2 – Cálculo das concentrações e número de cópias do genoma mitocondrial das

diluições seriadas da solução padrão de ADN.

STD 1 STD 2 STD 3 STD 4 STD 5 STD6 STD 7 STD 8 Concentração ADN genómico ng/µl 10 ng/µl 5 ng/µl 1 ng/µl 0,5 ng/µl 0,1 ng/µl 0,05 ng/µl 0,01 0,001 ng/µl Concentração ADN mitocondrial pg/µl 28 pg/µl 14 pg/µl 2,8 pg/µl 1,4 0,28 pg/µl pg/µl 0,14 0,028 pg/µl 0,0028 pg/µl Número de cópias de ADN mitocondrial 1647059 823529 164706 82353 16471 8235 1647 165

4. Dispensar, em cada um dos tubos a quantidade de água Milli-Q necessária, de acordo com a tabela. Agitar, durante 3-5 segundos, a solução padrão de ADN, no vórtex. Adicionar a quantidade de ADN padrão no tubo 1 e agitar novamente no vórtex.

5. Adicionar ao tubo com a designação STD2 a quantidade de STD1 preparado, de acordo com a tabela. Agitar bem este no vortex e, a partir deste, preparar o STD3 e, assim sucessivamente, até ao tubo 8, com o cuidado de agitar sempre no vortex, depois de preparar cada tubo de ADN padrão.

b) Preparação das reacções de amplificação

6. Efectuar os cálculos necessários para preparação de uma mistura, tendo em conta a tabela 3, e considerando o número de amostras a quantificar (incluindo as amostras de ADN padrão, uma amostra em branco, um controlo negativo e um controlo positivo). Acrescentar mais uma ou duas amostras para compensar os erros de pipetagem.

Tabela 3- Preparação das reacções de amplificação.

Reagentes (concentração) Volume

Taqman Universal Master Mix (1x) 6,25 µl

Primer A1F (100nM) 0,625 µl

Primer A1R (100nM) 0,625 µl

Sonda MGB (200nM) 1 µl

BSA (50ng/µl) 0,0625 µl

Água Milli-Q 2,9375 µl

Volume final mix 11,5 µl

ADN 1 µl

Volume final reacção 12,5 µl

7. Pipetar os volumes requeridos dos componentes para um tubo. Agitar no vortex, durante 3 a 5 segundos, e centrifugar brevemente.

8. Dispensar 11,5µl da mistura em cada poço da placa. Adicionar 1µl de ADN extraído das amostras-problema, das soluções padrão ou do controlo positivo nos poços respectivos.

9. Selar a placa com o plástico transparente Optical Adhesive Cover (Applied Biosystems), com a ajuda de um aplicador de plástico, tendo o cuidado para que não ocorra contaminação com qualquer tipo de sujidade, nesta película, ou a formação de bolhas, que possam interferir com a leitura dos resultados. Colocar a almofada de compressão em esponja de modo a que os buracos da almofada assentem directa e correctamente nos poços da placa.

10. Introduzir a placa no ABI Prism® 7000 Sequence Detection System no compartimento respectivo, introduzindo as seguintes condições para a reacção de amplificação:

50ºC 95ºC 95ºC 60ºC

2 minutos 10 minutos 15 segundos 1 minuto 45 ciclos

11. Iniciar o procedimento de amplificação na opção Start do software SDS (Applied Biosystems), e após o final da amplificação efectuar a análise dos dados, de acordo com o protocolo relativo a este software.