PROPEDÊUTICA COMPLEMENTAR

A avaliação laboratorial inicial, que já faz parte da propedêutica de rotina ao diagnóstico, continha hemograma completo; determinação do tempo de protrombina, atividade de protrombina e determinação do tempo de tromboplastina parcial ativado; determinação dos níveis séricos da alanina aminotransferase (ALT), da aspartato aminotransferase (AST), da fosfatase alcalina (FA) e da gamaglutamil transferase (GGT); dosagens das bilirrubinas séricas e das proteínas plasmáticas com fracionamento eletroforético para avaliação principalmente do perfil hepático do paciente.

Foi realizada também pesquisa quantitativa e qualitativa dos autoanticorpos através da técnica de imunofluorêscencia indireta (IFI): antinuclear (FAN), antimúsculo liso

(AML), antimicrossomal fígado e rim (anti-LKM1) e citoplasmático antineutrofílico perinuclear (p-ANCA), sendo esse último realizado na suspeita de CEP.

Avaliação laboratorial quantitativa de α1-antitripsina, cobre e ceruloplasmina sérica, dosagem do cobre urinário de 24 horas; pesquisa de marcadores virais: HBsAg, anti-HBc, anti-HCV 2a geração e anti-HAV IgM e pesquisa do vírus da hepatite C (HCV), quando sorologia positiva, foram realizadas para exclusão de outras doenças hepáticas. Os dados foram obtidos de registros em prontuário e diretamente no laboratório quando necessário.

Imunofenotipagem

Para esta avaliação a pesquisa contou com apoio financeiro da CAPES, através do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Medicina Molecular da UFMG (FAPEMIG: CBB-APQ-00075-09/CNPq 573646/2008-2).

Foi realizada coleta de sangue venoso de aproximadamente 10 mL para imunofenotipagem e estudo dos perfis de marcadores de superfície relacionados à inflamação de linfócitos e monócitos. A coleta foi realizada durante os exames de rotina solicitados para acompanhamento do paciente.

A análise de citometria de fluxo para descrição do perfil de marcadores de superfície de linfócitos e monócitos foi realizada conforme descrito por Torres et al3. As células mononucleares de sangue periférico foram obtidas com utilização de gradiente de Ficoll (Sigma Chemical Co., Missouri, USA) e posteriormente foram coradas utilizando- se fluorocromos para os marcadores a serem analisados. Os anticorpos associados aos fluorocromos Fluorescein isothiocyanate (FITC), Phycoerythrin (PE), Allophycocyanin (APC) e Cyanin 5 e 7 utilizados para a coloração foram anti-CD4-APCCy7, anti-CD4- Cy7, anti-CD8-FITC, anti-CD8-APC, anti-CD14-FITC, anti-CD45RA-FITC, anti- CD45RO-PE, anti-CTLA4-Cy5, anti-CD69-Cy7, anti-CD28-PE, anti-CD40L-Cy5, anti- HLA-DR-Cy7, anti-CD95L-PE, anti-CD95-Cy5, anti-CD25-Cy7, anti-CCR3-PE, anti- CCR5-Cy5, anti-CD80-Cy5, anti-CD86-APC. Em todos os experimentos também foram utilizados anticorpos isótopos de controle negativo conjugados com fluorocromos de acordo com o anticorpo de referência.

Após fixação e ressuspensão, as amostras foram adquiridas em citômetro de fluxo (Guava easy-Cyte, Millipore®, Darmstadt, Alemanha ou FACSCanto II® BD, Califórnia, EUA) numa taxa mínima de 50000 eventos e analisadas pelo software FlowJo 7.5® (FlowJo, Oregon, USA). Para uma determinação das células correspondentes a linfócitos e monócitos, determinou-se a região a ser analisada pela construção de gates de acordo com

controles de tamanho relativo e granulosidade/complexidade em cada experimento e para cada paciente, sendo um exemplo demonstrado na Figura 1.

Figura 1: Dot-plot representando o método de seleção de gates utilizados para linfócitos em A e de monócitos em B.

Foram avaliadas as porcentagens de linfócitos CD4+ e CD8+ e monócitos (CD14+) expressando os marcadores de superfície em avaliação. As porcentagens de expressão resultantes foram utilizadas para a comparação entre os grupos através de testes estatísticos descritos no item análise estatística. Os marcadores de superfície analisados foram: CD45RA, CD45RO, CTLA-4, CD69, HLA-DR, CD28, CD40L, CD25, CD95, CD95L, CCR3, CCR5, CD80, CD86. Nessa avaliação tentou-se pesquisar a ativação de linfócitos e monócitos; e a presença de células de memória e de regulação imunes.

Avaliação radiológica

Conforme rotina do serviço, foram solicitados exames ultrassonográficos de fígado e vias biliares (todos os pacientes) e colangiorressonância (na suspeita de colangite associada à HAI ou na CEP) sendo, revisados e avaliados por três hepatologistas experientes da equipe de Hepatologia Pediátrica e dois radiologistas do serviço de Radiologia do Hospital das Clínicas da UFMG.

Avaliação histológica

As biópsias hepáticas são indicadas no momento do diagnóstico e realizadas tão logo as condições clínicas e laboratoriais do paciente permitam. A avaliação histopatológica foi realizada pela equipe de patologistas do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital das Clínicas da UFMG.

A

B

Tamanho (Foward Scatter-FSC)

Gr anulos idade (Side Sca tt er - S S C )

O achado histológico de hepatite de interface, associada à formação de rosetas, alargamento dos espaços portais por fibrose e infiltrado inflamatório principalmente plasmocitário em espaços periportais, portais e intralobulares representou o quadro histológico de hepatite autoimune. Quando, além desses achados, encontrou-se acometimento de ductos por inflamação com alterações degenerativas do epitélio ductular, podendo haver também ductopenia e proliferação de ductos, confirmou-se o diagnóstico de hepatite autoimune com associação à colangite autoimune.

Os achados de degeneração do epitélio do ducto biliar, infiltração de espaços porta por células mononucleares e polimorfonucleares, proliferação de ductos associados com diminuição ou ausência de ductos biliares interlobulares e fibrose periductal concêntrica de ductos biliares interlobulares (fibrose "em casca de cebola") foram os achados histológicos utilizados para confirmar a CEP.

Além da classificação histológica do tipo de doença, descrita anteriormente, foram avaliados a graduação e o estadiamento das alterações hepáticas. A graduação é demonstrada pela ausência ou presença de necrose em saca-bocados, necrose confluente, necrose lítica focal, apoptose, alterações em ductos biliares, inflamação focal e inflamação portal com as respectivas intensidades. Através do estadiamento, avaliaram-se a presença e a quantidade de fibrose; o estágio final foi caracterizado por cirrose incipiente ou definitiva.