As propriedades eletrofisiológicas passivas intrínsecas dos neurônios pré simpáticos da RVLM de ratos controle

A região RVLM faz parte da formação reticular do bulbo e em ratos com idade superior à 21 dias a maturação da rede neuronal dificulta a visualização dos neurônios pré-simpáticos para a realização de registros eletrofisiológicos. Além disso, como descrito anteriormente, a RVLM abriga populações distintas de neurônios (pré-simpáticos e respiratórios) e o foco deste estudo foram os neurônios pré-simpáticos bulbo-espinhais da RVLM, ou seja, aqueles neurônios que enviam projeções excitatórias para a CIL e são responsáveis pela geração da atividade simpática.

Com o objetivo de se investigar os efeitos da exposição à HA sobre a atividade dos neurônios pré-simpáticos da RVLM, primeiramente nos atentamos para o registro eletrofisiológico basal, utilizando a técnica de whole-cell patch-clamp, de neurônios localizados nessa região e que foram marcados por meio da microinjeção de rodamina, um traçador fluorescente retrógrado, na CIL de animais jovens adultos (P35). Vale ressaltar as dificuldades técnicas utilizadas no desenvolvimento desse trabalho para se obter os registros eletrofisiológicos de neurônios pré-simpáticos bulboespinhais da RVLM em fatias do tronco cerebral de ratos com idade superior a 12 dias, uma vez que o índice de acerto da microinjeção na CIL e a manutenção da viabilidade das células para registro foram fatores limitantes. Além disso, é oportuno destacar que importantes avanços no registro eletrofisiológicos de neurônios pré-simpáticos da RVLM em fatias de tronco cerebral de animais adultos jovens (33-35 dias) foram realizados no nosso laboratório por Almado (Tese de Doutoramento, 2012), pois nos estudos existentes na literatura os registros desses neurônios foram feitos em preparações obtidas de ratos

neonatos (Johnson et al., 1994; Koshiya & Smith, 1999; Mellen et al., 2004; Mazza et

al., 2009). A técnica da marcação retrógrada para identificar os neurônios pré-simpáticos

bulboespinhais descrita previamente (Sun et al., 1988; Almado et al., 2014) foi efetiva para a identificação dos neurônios pré-simpáticos a serem registrados, como mostrado na figura 4 em materiais e métodos.

Após a visualização dos neurônios pré-simpáticos da RVLM com marcação retrógrada positiva e a constatação da viabilidade da célula, utilizamos a configuração

whole-cell patch-clamp para o registro eletrofisiológico da atividade elétrica da célula.

Primeiramente, as fatias foram perfundidas com aCSF na condição controle e registramos um total de 104 neurônios pré-simpáticos de animais controle que apresentaram marcação positiva. Verificamos que todos os neurônios apresentaram padrão de auto- despolarização, característico das células marca-passo (figura 10) conforme mostrado em estudos de Almado et al. (2014) e de Sun et al. (1988) que utilizaram esta mesma abordagem experimental.

Figura 10: Registro basal na configuração current-clamp de um neurônio pré-simpático da RVLM representativo do grupo, mostrando o padrão auto-despolarizante de disparo dos PAs.

Vo lt a g em (mV)

Do total de 104 neurônios pré-simpáticos registrados em fatias do tronco cerebral de animais controle, 15 foram descartados de acordo com os nossos critérios de exclusão descritos anteriormente. Numa primeira etapa foram avaliados nos registros eletrofisiológicos de 89 neurônios pré-simpáticos o potencial de membrana em repouso (RMP), a frequência de disparos de PAs, a capacitância e a resistência de entrada. Com o registro basal dos neurônios no modo current-clamp, observamos que a média de frequência de disparo de PAs foi de 6,30 ± 0,41 Hz; o RMP de – 63,62 ± 0,28 mV e capacitância 32,64 ± 0,51 pF (painéis A, B e C da figura 11, respectivamente). Observamos que os 75 neurônios registrados apresentaram Rinput de 488,6 ± 41,49 MΩ (painel D figura 11).

Figura 11. Painel A: Distribuição da frequência média de disparo basal dos neurônios pré-

simpáticos da RVLM do grupo controle. Painel B: Distribuição dos valores médios do potencial de repouso da membrana (RMP) do grupo controle. Painel C: Distribuição dos valores da capacitância e Painel D: Distribuição dos valores médios da Rinput (n=75).

Basal 0 200 400 600 800 R in p u t ( M ) A B C D

Como o primeiro objetivo de nosso trabalho foi avaliar os efeitos da HA sobre as propriedades eletrofisiológicas intrínsecas passivas e ativas dos neurônios pré-simpáticos em fatias do tronco cerebral de ratos adultos jovens (P35), fez-se necessário o bloqueio completo dos receptores dos neurotransmissores excitatórios e inibitórios que poderiam modular o padrão de disparo de PAs e as características eletrofisiológicas desses neurônios. Para a realização deste protocolo, decorrido o tempo do registro em condições basais dos neurônios pré-simpáticos, as fatias foram perfundidas com solução de aCSF contendo um coquetel de bloqueadores sinápticos a fim de inibir as influências gabaérgicas (picrotoxina, 100 µM); glutamatérgicas (AP-5, 40 µM; DNQX, 10 µM) e glicinérgicas (estriquinina, 1 µM) e borbulhadas com mistura carbogênica padrão (95% O2 e 5% CO2).

Entre os 89 neurônios pré-simpáticos da RVLM que registramos em condições basais, obtivemos o registro de 60 deles sob o efeito do BS completo. A análise das propriedades intrínsecas dos neurônios registrados foi feita comparando os dados obtidos nas duas condições experimentais. A fim de verificarmos a efetividade do BS, decorridos 5 minutos de registros eletrofisiológicos, sob a perfusão com aCSF na presença dos bloqueadores sinápticos, registramos em voltage-clamp a ausência de correntes excitatórias e inibitórias (painel B, figura 12) comparadas ao seu respectivo controle (painel A, figura 12).

Figura 12. Painel A: Traçado representativo do registro das correntes em voltage-clamp na

condição basal e Painel B: após o bloqueio sináptico, condição na qual observamos a ausência das correntes.

Verificamos que todos os neurônios pré-simpáticos registrados na presença do BS (n=60) continuaram apresentando um padrão intrínseco de auto-despolarização (figura 13). Com o registro eletrofisiológico no modo current-clamp, observamos que a média de frequência de disparo de PAs na condição basal foi de 6,8 ± 0,5 Hz e que o bloqueio da atividade sináptica promoveu uma significativa redução na frequência de PAs desses neurônios [CON= 6,8 ± 0,5 Hz vs BS= 5,8 ± 0,4 Hz; (n=60), teste t pareado, p < 0,05; figura 13 C)]. Esses resultados corroboram observações de Sun et al. (1988), Guyenet (2006) e Almado et al. (2014), os quais mostraram que os neurônios pré-simpáticos bulboespinhais apresentam atividade intrínseca de auto-despolarização.

A diminuição da frequência de disparo de PAs após o BS reflete a existência de uma modulação sináptica excitatória tônica sobre esses neurônios na condição experimental basal na qual foram registrados. Embora muitas projeções neurais que estabeleciam contato sináptico com os neurônios registrados tenham sido seccionadas

200 ms

20 p

A

quando da obtenção das fatias do tronco cerebral, esses neurônios continuaram recebendo influências excitatórias tônicas das projeções neuronais remanescentes na fatia.

CON BS 0 5 10 15 20 _* F re q u ê n c ia m é d ia ( H z )

Figura 13. Registro eletrofisiológico representativo de um neurônio pré-simpático: Painel A –

sob a perfusão de aCSF na condição controle e Painel B – na presença dos bloqueadores