ANTIMICROBIANAS
3.1.1 Seleção de material floral
A seleção de 10 plantas ornamentais e do Cerrado foi realizada (Tabela 3) objetivando a prospecção de moléculas proteicas antimicrobianas. As flores foram coletadas em regiões arborizadas do Plano Piloto (DF), ou adquiridas em floricultura local. A seleção foi realizada baseando-se na disponibilidade e quantidade de tecido floral. Para a extração do material proteico foram utilizadas as estruturas florais pétalas, brácteas, lígulas, inflorescências, espatas e espádices (Figura 4). Na Tabela 2 segue a discriminação das plantas e respectivas estruturas utilizadas nesse experimento.
Tabela 2: Relação de plantas e suas respectivas estruturas utilizadas para prospecção de moléculas proteicas
antimicrobianas.
Nome Popular Espécie Estrutura Utilizada Quantidade de amostra
(Flores)
Vinca Catharanthus roseus Pétalas 50
Pata de vaca Bauhinia variegata Pétalas 50
Bouganvilea Bouganvillea glabra Brácteas 50
Rosa Rosa sp. Pétalas 50
Espirradeira Nerium oleander Pétalas 50
Margarida Bellis sp. Lígulas 50
Lisiantus Lisianthus Pétalas 50
Cravo Dianthus caryophyllus Pétalas 50
Grevílea Grevillea banskii Inflorescência 50
3.1.2 Extração da fração rica em proteína dos tecidos florais
A técnica utilizada para as amostras de pétalas, brácteas, lígulas e inflorescências foi a extração ácida (1% de HCl adicionado de 0,6 M de NaCl (1:3 m/v) seguida de precipitação com sulfato de amônio (0-100%). Foi utilizado um pool com 50 flores para cada extração proteica dos tecidos florais, com exceção de Z. aethiopica, foi realizado conforme discriminado na Tabela 2. Estas flores foram coletadas em jardins, parques e espaços arborizados da região do Distrito Federal/Brasil, com exceção das espécies Bellis sp., Lisianthus sp., Rosa sp., Dianthus caryophillus e Z. aethiopica foram compradas floricultura local. Para todas as espécies citadas anteriormente, exceto para Z. aethiopica tecido floral foi Figura 4: Tecidos florais utilizados na prospecção de peptídeos antimicrobianos. Estão assinalados com setas os
tecidos específicos utilizados de cada espécie vegetal. Catharanthus roseus foi utilizada como modelo para exemplificação do tecido pétalas. Fontes: Nicholson (1884), Whitney (1911), Bailey (1917) e (1917) e Gardens (2011).
macerado em nitrogênio líquido e em seguida as proteínas foram extraídas utilizando solução extratora (HCl 1% adicionado de NaCl 0,6 M (1:3 m/v)) em câmara fria, sob agitação constante, por 12 h. O extrato foi centrifugado a 5000 g a 4 ºC, e o sobrenadante submetido à precipitação com sulfato de amônio (0-100%), a 4ºC, por 12 h. Após a precipitação, o material foi dialisado em membrana de diálise com cut off de 500 Da (Spectrum® Laboratories) contra água destilada, durante 12 h, perfazendo 5 trocas. Em seguida, a amostra foi centrifugada a 5000 x g por 20 min, a 4ºC. Após nova centrifugação, o sobrenadante foi filtrado em membrana de celulose de 0,22 µm, liofilizado e acondicionado em refrigerador – 20 ºC até utilização para bioensaio.
3.1.3 Extração proteica de espatas e espádices de Z. aethiopica para utilização em ensaio antimicrobiano
Para cada extração proteica foi utilizado um pool de 36 flores. O tecido das espatas e espádices foi triturado com o auxílio de um liquidificador juntamente com tampão Tris-HCl 0,1 M pH 7,0. A extração das proteínas ocorreu em câmara fria, sob agitação constante durante 12 h. O extrato foi centrifugado a 5000 x g a 4ºC, e o sobrenadante submetido à precipitação com sulfato de amônio (0-100%) por 12 h. Após a precipitação, o material foi dialisado em membrana de diálise com cut off de 500 Da (Spectrum® Laboratories) contra água destilada, durante 12 h, perfazendo 5 trocas da água. Em seguida, o material foi centrifugado a 5000 x g por 20 min, a 4ºC. Após nova centrifugação, o sobrenadante foi filtrado em membrana de 0,22 µm, liofilizado e acondicionado em refrigerador -20ºC até utilização para bioensaio.
3.1.4 Dosagem proteica da fração rica em proteínas dos tecidos florais
Previamente aos bioensaios, a concentração proteica das amostras foi aferida. Foram utilizados quatro métodos a fim de se estabelecer o mais adequado para a amostra em estudo. Foram testados os métodos de Bradford (1976) utilizando-se o reagente preparado Bradford Fast Start (BioRad), Qubit® (Invitrogen), BioRad Protein Assay (BioRad) e o kit RCDC (BioRad), seguindo as instruções do fabricante. Para fins de padronização de protocolo, foi adotado o método de RCDC (BioRad) para todas as quantificações proteicas subsequentes, esse método se baseia nos procedimentos de quantificação propostos por Lowry (1951). Para ensaios em tubos de 1,5 mL preparou-se o Reagente A’ (5 µL do Reagente S para cada 250
µL do Reagente A que será necessário para a corrida). Para cada amostra padrão ou amostra testada foram utilizados 127 µL do Reagente A’. Foram preparadas de 3 a 5 diluições de
proteína padrão (soroalbumina bovina), com concentração variando de 0,2 a 1,5 mg.mL-1 de proteína. A curva padrão foi preparada todas as vezes em que o procedimento de quantificação foi realizado. Os padrões foram preparados utilizando-se o mesmo tampão (ou água) no qual a amostra biológica foi ressuspendida.
Foram adicionados 25 µL de cada padrão e das amostras em tubos de 1,5 limpos, em triplicata. Em seguida foram adicionados 125 µL do Reagente I em cada tubo e agitados vigorosamente. As reações foram mantidas por 1 min à temperatura ambiente. Posteriormente, foram adicionados 125 µL do Reagente II em cada tubo e agitados vigorosamente. Imediatamente após essa etapa, os tubos foram centrifugados a 15 000 g por 3 – 5 min. O sobrenadante foi descartado invertendo-se os tubos em papel absorvente limpo até remoção total do líquido. Foram adicionados 127 µL do Reagente A’ em cada tubo e agitados
vigorosamente. Os tubos foram mantidos em temperatura ambiente por 5 min, ou até o precipitado se dissolver completamente. Em seguida procedeu-se com agitação vigorosa de cada tubo. Foi adicionado do 1 mL do Reagente B em cada tubo e agitado imediatamente. A reação foi mantida em temperatura ambiente por 15 min. Após o tempo de reação, foi realizada leitura da absorbância à 750 nm. A reação se mantém estável por 1h, não interferindo nas leituras de absorbância.
3.1.5 Ensaios antibacterianos
A atividade antibacteriana da amostra liofilizada de tecido floral foi testada em ensaios em caldo, utilizando-se microplaca de 96 poços. Almejando assegurar confiabilidade dos experimentos foi utilizado o método de semeadura por esgotamento para obtenção de colônia isolada (NCCLS, 2003). Posteriormente a colônia isolada foi incubada em 2 mL de caldo de cultura Luria-Bertani (LB) (10 g.l-1 de NaCl, 5 g.l-1 de extrato de levedura e 45 g.l-1 de bactopeptona, dissolvidos em água destilada e autoclavados), 37 ºC e agitação de 240 rpm por 12 h para obtenção de pré-inóculo. Posteriormente, um volume de 0,1 mL do pré-inóculo foi cultivado em 3 mL de caldo LB nas mesmas condições do pré- inóculo, até que a densidade ótica atingisse a metade da fase logarítmica. O ensaio foi conduzido como descrito brevemente; o volume final de cada poço da microplaca foi de 0,1 mL, a concentração final da bactéria neste volume, correspondeu a 5.105 UFC.mL-1
(Unidades Formadoras de Colônia) e as concentrações das amostras florais foram previamente determinadas pelo método de RCDC (BioRad). Água destilada estéril foi utilizada como controle negativo e cloranfenicol (40 μg.mL-1) como controle positivo de inibição bacteriana. A amostra proteica na concentração de 200 µg.mL-1 foi incubada com a bactéria em caldo LB, por 4 h, a 37 ºC com agitação constante de 50 rpm. A evolução do crescimento bacteriano foi monitorada por meio de espectrofotometria através do comprimento de onda de 595 nm, durante cada hora experimental, de modo a determinar cada fase de crescimento bacteriano. O experimento foi realizado em triplicata. Os ensaios foram feitos contra as bactérias Escherichia coli (ATCC8739) e Staphylococcus aureus (ATCC29213) para todos os extratos proteicos florais. O material floral com maior índice de inibição do crescimento bacteriano foi selecionado para análises transcriptômica e proteômicas posteriores.