Proteína morfogénica óssea 2 (BMP-2)

Também denominada proteína morfogénica óssea. É uma glicoproteína, pertencente à família dos factores de crescimento . Desempenha um papel importante na formação do osso e da cartilagem, ao induzir a diferenciação celular, nomeadamente a osteoblástica (149).

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III

MATERIAIS E MÉTODOS

1. IMPLANTES UTILIZADOS

Neste trabalho de investigação foi utilizada uma amostra de 348 implantes, confeccionados em titânio comercialmente puro, de graus III ou IV, apresentando desenho cónico ou cilíndrico, tipo parafuso, com espiras e estrutura compacta. As dimensões dos implantes utilizados variaram entre os 8 e 15 mm de comprimento e entre os 3,0 e 5,0 mm de diâmetro (figura 3.1).

Figura 3.1 – Um exemplar pertencente a cada um dos seis grupos de implantes.

Os implantes foram adquiridos a duas marcas comerciais, sendo representativos dos mercados italiano e espanhol, encontrando-se presentemente em utilização clínica, com comprovado sucesso clínico.

Todas as amostras apresentavam-se dentro do prazo de validade de utilização, devidamente acondicionadas e esterilizadas, na sua embalagem de origem. Estas foram abertas apenas no momento da sua manipulação.

Os implantes foram divididos em seis grupos, de acordo com a sua macroestrutura (número e distância entre espiras) e microtopografia (tipo de tratamento de superfície).

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GRUPO 1 – Cinquenta e oito implantes maquinados, em titânio comercialmente puro, grau IV, com 3,0 mm de diâmetro e 15,0 mm de comprimento. Apresentavam uma distância entre espiras de 566 µm e uma distância topo-fundo de 354 µm (figura 3.2).

Figura 3.2 - Implante do grupo 1. Maquinado I.

GRUPO 2 – Cinquenta e oito implantes maquinados, em titânio comercialmente puro, grau IV, com 3,0 mm de diâmetro e 15,0 mm de comprimento. A distância entre espiras era de 1200 µm e a distância topo-fundo de 322 µm (figura 3.3).

Figura 3.3 - Implante do grupo 2. Maquinado II.

GRUPO 3 – Cinquenta e oito implantes, em titânio comercialmente puro, grau IV, com superfície duplamente tratada, por jacteamento e ataque com ácido. As indicações referentes ao tipo de partículas e ao ácido utilizado não foram fornecidas pelo fabricante. Mediam 5,0 mm de diâmetro e 11,5 mm de comprimento. A distância entre espiras era de 557 µm e a distância topo-fundo de 346 mm (figura 3.4).

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Figura 3.4 - Implante do grupo 3. Jacteamento e ataque ácido I.

GRUPO 4 – Cinquenta e oito implantes, em titânio comercialmente puro, grau III. De acordo com o fabricante, a superfície foi duplamente tratada através da aplicação de um jacto de partículas de óxido de alumínio, seguido de um ataque químico, com ácido clorídrico, fluorídrico e sulfúrico. Apresentavam um diâmetro de 3,0 mm e um comprimento de 8,0 mm. A distância entre espiras era de 940 µm e a distância topo- fundo de 274 µm (figura 3.5).

Figura 3.5 - Implante do grupo 4. Jacteamento e ataque ácido II.

GRUPO 5 – Cinquenta e oito implantes, em titânio comercialmente puro, grau IV. De acordo com o fabricante, trata-se de uma evolução dos implantes incluídos no grupo 4. As diferenças entre eles estavam relacionadas com o grau de titânio com que são confeccionados e quanto ao protocolo de tratamento preconizado que utilizou as mesmas substâncias mas em condições de duração de tempo, temperatura, pressão e concentração dos ácidos, diferente. Essas condições não foram reveladas pelo fabricante.

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Apresentavam um diâmetro de 3,0 mm e um comprimento de 13,0 mm. A distância entre espiras era de 953 µm e a distância topo-fundo de 314 µm (figura 3.6).

Figura 3.6 - Implante do grupo 5. Jacteamento e ataque ácido III.

GRUPO 6 – Cinquenta e oito implantes, em titânio comercialmente puro, grau IV, com superfície tratada por método de adição, mediante aplicação de um spray de plasma de titânio (TPS), apresentando 4,2 mm de diâmetro e 14,0 mm de comprimento. A distância entre espiras era de 1190 µm e a distância topo-fundo de 294 mm (figura 3.7).

Figura 3.7 - Implante do grupo 6. Spray de plasma de titânio (TPS).

De acordo com o tipo de tratamento de superfície, os implantes foram divididos em três classes. A classe 1 formada pelos implantes dos grupos 1 e 2, maquinados, diferindo entre si na sua macrotopografia, concretamente, no número, na disposição e no

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afastamento das espiras. A classe 2 formada pelos implantes dos grupos 3, 4 e 5, submetidos a duplo tratamento, por método de subtracção, consistindo primeiramente no jacteamento da superfície, com diferentes partículas, seguido de um ataque ácido. A diferença entre estes três grupos residia no tipo de partículas e no tipo de ácido utilizado, bem como nas condições de temperatura, pressão e duração de tempo a que foram submetidos os implantes, não tendo essas condições sido reveladas pelos fabricantes. Na classe 3 foram incluídos os implantes do grupo 6, com superfície tratada por um método de adição, concretamente por aplicação de spray de plasma de titânio (figura 3.8).

Figura 3.8 - Classe 1 - grupos 1 e 2, maquinados. Classe 2 - grupos 3, 4 e 5, tratados por jacteamento e ataque ácido. Classe 3 - grupo 6, com revestimento obtido por spray de plasma de titânio (TPS).

No caso dos implantes submetidos a mais do que um tipo de tratamento de superfície tem maior influência o último tipo de tratamento utilizado.

Os pormenores relativos aos protocolos seguidos para as técnicas de TPS, jacteamento e ataque ácido não foram revelados nem foram encontrados detalhes na literatura nem nas indicações dos fabricantes.

2. PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS UTILIZADAS NAS CULTURAS CELULARES

2.1. Corte dos implantes

Da amostra inicial foram retirados, de forma aleatória e estratificada pelos diferentes grupos, quarenta e quatro implantes pertencentes a cada um dos grupos, para a análise do comportamento biológico de culturas celulares.

1

2

3

CLASSES

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Estes implantes foram cortados longitudinalmente, no sentido do seu longo eixo, e transversalmente, tendo os cortes sido realizados com recurso a um disco diamantado, montado num micrótomo para tecidos duros, não descalcificados (Acuttom, Struers, Dinamarca). O processo foi executado a 2500 rotações por minuto, a baixa pressão, sob refrigeração abundante e lubrificação com soro fisiológico (figuras 3.9 e 3.10).

Figura 3.9 – Micrótomo de tecidos duros. Figura 3.10 – Corte dos implantes.

Com vista a conseguir-se a sua fixação, durante o corte, os implantes foram semi- incluídos, em resina epofix, tendo sido utilizado um molde maleável, onde permaneceram por um período de 24 horas, até ocorrer o endurecimento da resina. Com este procedimento, a parte cervical do implante ficou incluída em resina (figuras 3.11 e 3.12).

Figura 3.11 – Imersão da porção cervical dos implantes em resina epofix.

Figura 3.12 – Porção cervical de um implante imersa em resina epofix.

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Utilizando esta metodologia foi possível obter amostras, a partir dos implantes, com uma parte plana, susceptível de proporcionar estabilidade quando colocados nos poços de cultura (figuras 3.13 e 3.14).

Figura 3.13 – Implantes cortados. Figura 3.14 – Implantes colocados nos poços das placas de cultura.

Foram cortados apenas os implantes que foram utilizados nas experiências a realizar com culturas celulares.

2.2. Lavagem e esterilização das amostras

Uma vez cortados, e antes da realização do trabalho in vitro, as amostras foram submetidas a um processo de limpeza metalográfica, em banho ultra-sónico (figura 3.15), com máxima intensidade, de acordo com a seguinte sequência:

1- imersão em acetona, pureza analítica, durante 15 minutos;

2- imersão em álcool etílico a 70% (álcool etílico diluído em água destilada na proporção de 70%-30%), durante 15 minutos;

3- imersão em álcool etílico a 99,8%, durante 15 minutos e finalmente; 4- imersão em água destilada, durante 15 minutos.

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Este procedimento teve a duração total de 60 minutos, tendo como objectivo a lavagem, limpeza e desengorduramento dos implantes.

Figura 3.15 – Limpeza dos implantes em banho ultra-sónico.

Após este procedimento, procedeu-se à secagem das amostras numa estufa de marca HERAEUS ELECTRONIC (Gaprüfte Sicherheit, Alemanha), tendo sido submetidas a uma temperatura de 37°C, durante 24 horas (figura 3.16).

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Seguidamente, as amostras foram acondicionadas em mangas individuais (figura 3.17) e submetidas a um processo de esterilização, a uma temperatura de 121°C e uma pressão de 124 KPa, durante 45 minutos (figura 3.18), realizado em autoclave, de marca OMRON ESCS.

Figura 3.17 – Amostras colocadas em mangas individuais.

Figura 3.18 – Autoclave OMRON ESCS.

Com estes procedimentos, procurou-se que todas estas amostras se encontrassem limpas de gorduras e de outras impurezas e devidamente esterilizadas.

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De modo a garantir que os implantes utilizados na fase de caracterização topográfica e química se encontravam nas mesmas condições que os implantes utilizados na análise do comportamento biológico, todos os implantes utilizados nessa fase da investigação, também foram submetidos a este mesmo protocolo de limpeza e esterilização.

3. CARACTERIZAÇÃO DA SUPERFÍCIE DOS IMPLANTES

Para a caracterização, topográfica e química, da superfície dos implantes, foram utilizadas cinco técnicas:

a) Microscopia Electrónica de Varrimento,

- foi realizada no Centro de Materiais da Universidade do Porto (CEMUP) tendo sido utilizado um aparelho de marca JEOL JSM6301F (figura 3.19).

Figura 3.19 – Microscópio Electrónico de Varrimento, JEOL JSM6301F (CEMUP).

b) Microscopia Confocal de Varrimento Laser,

- foi realizada no Instituto de Biologia Molecular e Celular da Universidade do Porto (IBMC), tendo-se utilizado um Microscópio Confocal de Varrimento Laser, Leica SP2 AOBS SE (Leica Microsystems, Alemanha) (figura 3.20).

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Figura 3.20 – Microscópio Confocal de Varrimento Laser, Leica SP2 AOBS SE (Leica Microsystems, Alemanha) (IBMC).

c) Espectroscopia de fotoelectrões por Raios-X (XPS),

- Esta análise, realizada no CEMUP, recorreu a uma unidade ESCALAB 200A da VG Scientific (UK) com programa informático de aquisição e análise de dados PISCES (figuras 3.21 e 3.22).

Figuras 3.21 e 3.22 - Unidade ESCALAB 200A da VG Scientific (UK) com programa informático de aquisição e análise de dados PISCES (CEMUP).

d) Espectroscopia por Dispersão de Energia (EDS),

- foi realizada utilizando um sistema de espectroscopia de raios X Inca Energy 350, de marca Oxford Instruments, associado a um Microscópio Electrónico de

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Varrimento JEOL JSM6301F (figura 3.19). Esta análise foi executada igualmente no CEMUP.

e) Profilometria mecânica.

- a realização desta análise recorreu a um aparelho de marca Hommel Werke, Turbo Wave V7.20 (Hommel AG, Hamburgo, Alemanha) (figuras 3.23 e 3.24), tendo sido realizada na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto (FEUP).

Figuras 3.23 e 3.24 – Profilómetro mecânico Hommel Werke, Turbo Wave V7.20 (Hommel AG, Hamburgo, Alemanha) (FEUP).

As amostras utilizadas para qualquer uma das cinco técnicas referidas, não necessitaram de qualquer tipo de tratamento prévio, para além do anteriormente referido processo de preparação/esterilização, tendo sido examinada a superfície exposta.

3.1. Macro e microtopografia