2. REVISÃO DE LITERATURA
2.2. Fatores que afetam a maturação oocitária
2.2.2. Proteínas envolvidas no controle do ciclo celular
O ciclo celular em células animais consiste em um ciclo de replicação do DNA cromossômico na fase S que procede ao estádio completo de diplóteno da primeira prófase e é detida na diacinese. Este estádio corresponde à fase G2 do ciclo celular e é caracterizado por cromossomos difusos cercados por uma membrana nuclear intacta chamada vesícula germinativa (VG). O reinício da meiose, onde ocorre um crescimento total dos oócitos após a puberdade, representa a transição da fase G2 para a fase M e envolve a condensação da cromatina, a VGBD, formação do fuso mitótico e segregação do cromossomo replicado em núcleos “filhos” na fase M (DEKEL, 1995; 1999).
A regulação da divisão do ciclo celular tem sido o assunto de muitos estudos durante os últimos anos (MURRAY e HUNT, 1993; DOREE e HUNT, 2002). Entre os reguladores do ciclo celular, as cinases dependentes de ciclinas exercem um papel central no início e na ordenação dos eventos do ciclo celular, ou seja, regulam a progressão das fases G1, S, G2 e M (GOULD, 1995; GRANA e REDDY, 1995;
MORGAN, 1995; PINES, 1995; KNOCKAERT et al., 2002).
Inúmeros estudos vêm mostrando que os eventos ocorridos no processo de maturação nuclear são acompanhados por mudanças específicas na fosforilação de proteínas controladas por enzimas que são modificadas pela transdução de sinais (WANG e LIU, 2004). Uma enzima importante é o fator promotor da maturação (MPF), a qual pertence ao grupo de proteínas cinases dependentes de ciclinas (MASUI e MARKERT, 1971). O MPF é uma proteína cinase que consiste de duas subunidades, uma cinase p34cdc2 catalítica e uma ciclina B regulatória (ALBERTS et al., 1997;
MOTLIK et al., 1999; DOREE e HUNT, 2002). A atividade do complexo ocorre na entrada da fase-M, ou seja, quando há o rompimento da VG marcando o final da prófase I, mas requer a desfosforilação da p34cdc2 cinase com remoção dos fósforos da treonina 14 e tirosina 15 (JOSEFSBERG et al., 2001; VAILLANT et al., 2001). Um rápido declínio na atividade do MPF ocorre durante o período de transição entre a MI e MII. O MPF é reativado rapidamente para entrar na MII e mantido em altas concentrações durante a MII (Figura 02) (BRUNET e MARO, 2005).
A desfosforilação da forma p34cdc2 (forma ativa) presente em oócitos retidos na fase G2 desaparece logo após o início da meiose com nenhuma mudança até a MII (POLANSKI e KUBIAK, 1999). O processo da condensação dos cromossomos durante a fase M, em muitas espécies, é acompanhado por fosforilações da histona H1 e da histona H3, que são substratos do MPF (KUBELKA et al., 2000). A atividade cinase da histona H1, que está alta durante a MI e MII, diminuiu com a extrusão do corpúsculo polar. Estes resultados sugerem que, na maturação de oócitos de mamíferos, a desfosforilação da p34cdc2 dispara esta ativação na primeira metáfase (POLANSKI e KUBIAK, 1999).
Figura 02: Atividades do MPF e MAPK durante a maturação nuclear. A atividade do MPF está representada em linha vermelha e a atividade da MAPK em linha verde (BRUNET e MARO, 2005).
Alguns estudos mostram que a atividade do MPF é encontrada na divisão mitótica das células, pois parece controlar a transição da G2 para a fase M, tanto na meiose quanto na mitose (POLANSKI e KUBIAK, 1999; BRUNET e MARO, 2005). O início da ativação do MPF ocorre em cerca de 7 h (progressão VG – MI) após o inicio da maturação in vitro e alcança um pico ao término da primeira fase M (MI, 12 h).
Posteriormente, ocorre um declínio em sua atividade durante a transição entre a MI e MII. Esse fator é reativado para entrar na MII e mantido em níveis altos durante o segundo bloqueio em MII (24 h) (POLANSKI e KUBIAK, 1999, KUBELKA et al., 2000;
LEDAN et al., 2001).
Segundo VERDE et al. (1990) e KIM et al. (2000), o MPF regula diretamente algumas mudanças morfológicas que ocorrem durante a fase M. Por exemplo, o MPF pode converter o estado de intérfase dos microtúbulos para uma configuração de metáfase in vitro. Porém, a relação entre a condensação dos cromossomos durante a fase M e a ativação do MPF ainda apresenta algumas controvérsias (KUBELKA et al., 2000; BRUNET e MARO, 2005).
Recentemente, tem sido sugerido que o fator-chave que controla a meiose é a síntese de ciclina B (SIRARD et al., 1998; BRUNET e MARO, 2005). Sugere-se, também, que os níveis de p34cdc2 não mudam na maturação de oócitos bovinos, em
VGBD Fertilização Pro-metáfase e metáfase I Metáfase II
contraste, a ciclina B está ausente em oócitos bovinos no momento de sua liberação do folículo, mas ela é sintetizada durante a maturação do mesmo, ou seja, após a VGBD, a síntese de ciclina B aumenta progressivamente, alcançando a concentração máxima no final da primeira fase M, associando-se imediatamente com a p34cdc2 para formar um complexo ativo (LEDAN et al., 2001). A degradação da ciclina B é requerida durante a extrusão do primeiro corpúsculo polar (TERRET et al., 2003). Assim, a atividade do MPF é regulada pelo mecanismo de transição dependente que determina a concentração da síntese de ciclina (BRUNET e MARO, 2005).
A injeção da proteína ciclina B1 humana em oócitos bovinos tratados com ciclohexamida dá início à retomada meiótica (LEVESQUE e SIRARD, 1996). Em camundongos, a síntese de ciclina B1 controla a duração da primeira fase M meiótica (POLANSKI et al., 1999). Em porcas, há uma quantidade extremamente pequena de pré-MPF na VG do oócito (NAITO et al., 1995). A ativação do MPF não é dependente da amplificação autocatalítica, mas requer atividade de síntese da proteína (FULKA et al., 1988). Segundo SUN et al. (2001a), há evidências de que a síntese de ciclina B1 determina a habilidade do oócito de porcas retomar a meiose.
Um segundo grupo importante de enzimas envolvidas na retomada da meiose são as proteínas da família das cinases ativadas por mitógenos, ou seja, as MAPK de membrana. Estas enzimas são ativadas por transdução de sinais específicos provenientes de sinais extracelulares. A ativação do MPF e da MAPK está temporalmente relacionada com a progressão da meiose (MASUI e MARKERT, 1971;
SUN et al., 1999; JONES, 2004).
As MAPK são os principais componentes celulares que controlam a embriogênese, diferenciação celular, proliferação celular e morte celular (PEARSON et al., 2001). Essas proteínas pertencem a uma família de serina/treonina cinases que são reguladas por uma cascata de fosforilação, ativadas pela MAPKK (MAP cinases-cinases, ativadora da MAPK) que fosforila os resíduos de tirosina e serina da MAPK (KUBELKA et al., 2000; LU et al., 2001; PEARSON et al., 2001). A atividade da MAPK pode ser associada à ativação do MPF. Paralelamente com o MPF, a ativação da MAPK ocorre em torno das 8 h e apresenta um aumento gradual, alcançando valores máximos entre 12 – 14 h e mantendo-se assim até completar as 24 h de maturação in vitro em oócitos bovinos (KUBELKA et al., 2000; JONES, 2004).
A parada do oócito na MII é causada, provavelmente, por dois fatores: o MPF e o fator citostático (CSF) (LIU et al., 1998). O CSF é uma proteína citoplasmática que também está envolvida na regulação dos processos de maturação (CHA e CHIAN, 1998; LIU e YANG, 1999; KUBELKA et al., 2000). A oncoproteína C-mos cinase e a MAP cinase são componentes do CSF, que, provavelmente, fazem parte da retro-alimentação positiva entre o MPF, C-mos e a cascata de MAPK, que são importantes para a maturação do oócito e parada do mesmo em MII (GOTOH et al., 1995; FISHER et al., 2000; VIVEIROS et al., 2001; VAILLANT et al., 2001). A C-mos é uma MAPKKK (MAP cinases-cinases-cinases) que ativa a MAPKK, que, por sua vez, ativa MAPK, que implica na parada do oócito em MII (GOTOH et al., 1995; KUBELKA et al., 2000;
VAILLANT et al., 2001). Já o CSF é o responsável por manter um nível elevado de MPF, e, portanto, a retenção em MII. A MAPK contribui para estabilizar a atividade ciclina B/cdk2 cinase (MOTLIK et al., 1999), mantendo o MPF em níveis elevados (JOSEFSBERG e et al., 2002).