Basso MF, Pereira HMB, Silva FN, Ramos HJO, Fontes EPB, Alfenas-Zerbini P & Zerbini FM. Busca por proteínas do hospedeiro candidatas a interagirem com a proteína de movimento do begomovírus Tomato yellow spot virus.
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INTRODUÇÃO
A família Geminiviridae é caracterizada pela morfologia de partículas icosaédricas geminadas e genoma composto por DNA de fita simples circular (Hanley-Bowdoin et al., 1999). A família é organizada em sete gêneros (Becurtovirus, Begomovirus, Curtovirus, Eragrovirus, Mastrevirus, Topocuvirus e Turncurtovirus) com base no número de componentes genômicos (mono- ou bissegmentados), organização genômica, relacionamento filogenético, tipo de inseto vetor (cigarrinha ou mosca-branca) e gama de hospedeiros (mono- ou dicotiledôneas) (Brown et al., 2012; Varsani et al., 2014).
Os vírus pertencentes ao gênero Begomovirus são de grande importância econômica, principalmente em regiões tropicais e subtropicais (Briddon, 2003; Monci et al., 2002; Morales & Anderson, 2001; Were et al., 2004). Infectam plantas dicotiledôneas e são transmitidos naturalmente pela "mosca-branca" Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) (Brown et al., 2012). Com base em estudos filogenéticos e características genômicas, os begomovírus são divididos em dois grupos: "Velho Mundo" (Europa, Ásia e África), caracterizados por serem na maioria dos casos monossegmentados e estarem associados a DNAs satélites (alfa- e betassatélites) (Mansoor et al., 2003), e "Novo Mundo" (as Américas), em sua maioria bissegmentados. Os dois componentes genômicos dos begomovírus bissegmentados são denominados DNA-A (que contém genes envolvidos na replicação, supressão de respostas de defesa da planta e encapsidação do genoma viral) e DNA-B (que contém genes envolvidos no movimento viral intra- e intercelular) (Rojas et al., 2005). Com exceção da região intergênica (aprox. 200 nucleotídeos) denominada região comum (RC), os dois componentes não apresentam identidade nucleotídica.
Após a replicação viral na primeira célula infectada, é necessário que o vírus se mova para o estabelecimento da infecção sistêmica. O movimento no interior do hospedeiro pode ser dividido em dois processos: movimento célula-a-célula via plasmodesmas e movimento a longa distância ou sistêmico, no qual o vírus atinge o sistema vascular e é transportado via
108 floema para outras partes da planta hospedeira. Para efetivar o movimento célula-a-célula, os begomovírus bissegmentados codificam uma proteína de movimento (movement protein; MP). Esta se associa à membrana do retículo endoplasmático, acumulando-se nos desmotúbulos e plasmodesmas e alterando o seu limite de exclusão de forma a facilitar o transporte do genoma viral (Ward et al., 1997; Noueiry et al., 1994; Lazarowitz & Beachy, 1999). Como os begomovírus se multiplicam no núcleo da célula hospedeira, é necessária uma etapa adicional de transporte núcleo-citoplasma, que é realizada pela proteína de transporte nuclear (nuclear shuttle protein; NSP) (Sanderfoot et al., 1996). Estas duas proteínas de movimento, atuando de maneira cooperativa, permitem que o vírus alcance o sistema vascular. A interação entre MP e NSP foi demonstrada por meio da re-localização de NSP por MP em protoplastos de N. tabacum e pela interação física no sistema duplo-híbrido de levedura (Sanderfoot & Lazarowitz, 1995; Mariano et al., 2004).
A MP dos begomovírus é classificada na superfamília 30K, na qual o transporte do genoma viral, na forma de nucleoproteína, é guiado pelos desmotúbulos que se movimentam através dos plasmodesmas por meio da ligação específica entre MP e o genoma viral (Rojas et al., 1998; Melcher, 2000). Em um primeiro modelo proposto, denominado couple-skating, NSP transporta o ssDNA ou dsDNA do núcleo para o citoplasma, e em seguida este complexo tem o movimento célula-a-célula mediado por MP (Sanderfoot & Lazarowitz, 1995; Frischmuth et al., 2007; Kleinow et al., 2008). No segundo modelo, denominado relay-race, NSP transfere o dsDNA do núcleo para o citoplasma e em seguida o dsDNA associa-se a MP e movimenta-se célula-a-célula através dos plasmodesmas (Noueiry et al., 1994; Rojas et al., 1998).
Para o estabelecimento da infecção sistêmica é necessária também a interação molecular entre fatores virais e do hospedeiro que possibilitem o movimento viral célula-a-célula e à longa distância (Sanderfoot & Lazarowitz, 1996). No entanto, há poucos trabalhos que demonstram interação direta da MP com fatores do hospedeiro (Krenz et al., 2010; Lewis &
109 Lazarowitz, 2010; Balmant, 2011). A identificação e o estudo de proteínas do hospedeiro que interagem direta ou indiretamente com esta proteína poderão contribuir para melhorar o entendimento do processo de infecção viral e da interação begomovírus-hospedeiro e fornecer novas estratégias de controle destas viroses, especialmente com relação a resistência do hospedeiro, seja ela natural ou derivada do patógeno.
O método TAP (tandem affinity purification) constitui uma ferramenta para a identificação in vivo de interações diretas ou indiretas entre proteínas (Rohila et al., 2004, 2006, 2009; Rubio et al., 2005; Dufresne et al., 2008). A etiqueta NTAP, fusionada na extremidade N-terminal da proteína alvo, é composta de um domínio peptídico de ligação a calmodulina (que se liga a esferas de calmodulina-agarose na presença de íons de cálcio), um sítio de clivagem proteolítica (AcTEV, originado do potyvírus Tobacco etch virus) e dois domínios da proteína A de Staphylococcus aureus (que se ligam a esferas de IgG-agarose), precedidos por um íntron que liga a proteína alvo, ambos em tandem e sob o controle do promotor 35S do Cauliflower mosaic virus. O método permite a purificação de proteínas complexadas a uma proteína alvo etiquetada, reduzindo assim a presença de proteínas "contaminantes" (não ligadas à etiqueta ou à proteína alvo) e facilitando a posterior identificação por espectrometria de massa (MS). Em plantas, o método TAP tem sido utilizado principalmente em Arabidopsis thaliana (Rubio et al., 2005; Van Leene et al., 2007; Dufresne et al., 2008; Thivierge et al., 2008), N. benthamiana (Rohila et al., 2004) e Oryza sativa (Rohila et al., 2006). Outro método que tem sido amplamente utilizado para estudos de interação proteína-proteína e purificação de complexos protéicos por afinidade é o pull-down baseado na proteína alvo fusionada a uma etiqueta de seis histidinas (6His) ou de glutationa S-transferase (GST) (McGarry et al., 2003).
Estas duas metodologias tem possibilitado a identificação e caracterização de diversas interações proteína-proteína e desta forma podem, teoricamente, ser empregadas para a identificação de proteínas do hospedeiro que interagem com a MP de begomovírus. Este
110 trabalho teve como objetivos identificar e caracterizar proteínas candidatas a interagirem com a MP do begomovírus Tomato yellow spot virus (ToYSV), utilizando o sistema TAP e a técnica de pull-down com etiqueta 6His.