A proteômica visa caracterizar o conjunto de proteínas expressas num dado momento em um tecido, fluído, célula ou organela, e, como qualquer metodologia, deve ser considerada parte integrante de um regime multidisciplinar. As análises devem envolver os dados gerados pelas técnicas denominadas de “ômicas” (Genômica, Transcritômica, Proteômica e Metabolômica), bem como informações provenientes da bioquímica clássica, da fisiologia e da biologia celular, compondo uma rede de análise coesa (JORRÍN-NOVO et al., 2009). O perfil protéico é uma informação muito útil para a validação da estrutura e da expressão gênica (BAGINSKY, 2008), mesmo ainda que permaneçam dúvidas em relação ao número de proteínas que um gene pode traduzir, resultado do splicing alternativo ou de alterações pós-traducionais. Cada vez mais a proteômica tem se firmado como uma ferramenta poderosa dentro dos programas de melhoramento genético, pois, diferente do que ocorre quando são utilizados marcadores fenotípicos ou baseados em DNA, a proteômica fornece informações em
nível molecular da variabilidade genética que é efetivamente expressa pelo genoma (PENNINGTON; DUNN, 2001).
Muitas técnicas podem ser empregadas para separar uma mistura complexa de proteínas, de modo que a separação por géis bi-dimensionais (2D-PAGE) é predominante. As principais críticas à essa técnica são a baixa precisão e a razoável reprodutibilidade. Porém, mesmo com algumas limitações, muitos investimentos têm sido realizados para aprimorar, por exemplo, a separação de proteínas hidrofóbicas, tecnologias de coloração de géis, captura e análise de imagens e robotização do processo baseado em 2D-PAGE (JORRÍN-NOVO et al., 2009). A tecnologia 2D-PAGE associada à espectrometria de massas tem sido a principal estratégia empregada pelos grupos de pesquisa (JORRÍN et al., 2007). A grande maioria dos estudos de proteômica em plantas são voltados para os perfis protéicos de vários órgãos, tecidos, células e organelas das principais culturas cultivadas (FUKUDA et al., 2003; SHEN et al., 2002).
As análises do proteoma de cana-de-açúcar ainda são muito pouco compreendidas. Os tecidos que compõem a planta de cana são materiais problemáticos do ponto de vista molecular, pois são tecidos que apresentam altos teores de fibras, altas concentrações de enzimas oxidativas, muitos compostos fenólicos e altas concentrações de carboidratos (especialmente a sacarose). Muitos dos artigos públicos envolvendo cana-de-açúcar enfatizam a extração de proteínas de folha simplesmente pela sua facilidade de coleta e extração, além de ser o tecido mais amplamente explorado. Até o momento, o trabalho publicado por Amaraj e colaboradores (2011) provavelmente é o único disponível na literatura que apresenta dados do proteoma do colmo da cana-de-açúcar. Neste mesmo trabalho, os autores focam sua investigação na comparação de algumas metodologias de extração de proteínas da folha e do colmo de cana, incluindo as extrações com ácido tricloroacético e fenol. De acordo com os resultados obtidos, a extração das proteínas com fenol apresentou melhor resultado, recuperando maior quantidade de proteínas na faixa de pH 5-7 (AMARAJ et al., 2011).
Um dos poucos trabalhos comparativos entre perfis protéicos compara proteínas de folha de cultivares resistente e suscetível de cana ao estresse hídrico objetiva a busca de um marcador fenotípico. Dados de espectrometria de massas e comparações
de sequências depositadas em banco de dados revelaram que a proteína p18 (proteína de 18 kDa) está positivamente relacionada à expressão da clorofila e da superóxido dismutase (SOD), apresentando a p18 como uma possível candidata para marca fenotípica em plantas de cana tolerantes à seca (JANGPROMMA et al., 2010).
Tendências de avanço da técnica proteômica têm apontado a técnica de MudPIT (Multidimensional Protein Identification Technology) como sendo a técnica que permite analisar um número grande de amostras num menor período de tempo com a mínima manipulação possível. Basicamente são empregadas duas colunas de cromatografia de princípios diferentes, uma de troca iônica e outra de hidrofobicidade. A técnica de MudPIT requer que todas as proteínas extraídas sejam digeridas e diretamente aplicadas em um sistema de separação (HPLC) e então analisadas por espectrometria de massas (LEE; COOPER, 2006).
No entanto, apenas a geração de dados proteômicos não resolve por si só a complexidade dos sistemas biológicos. É necessária a integração de dados oriundos da proteômica, genômica, transcritômica e metabolômica, o que não é uma tarefa trivial. A combinação desses dados requer parâmetros normalizadores, controle experimental rígido e uma visão holística para associar resultados estatísticos aos mecanismos moleculares da atividade celular.
3 OBJETIVOS
A rota da acumulação da sacarose em cana-de-açúcar foi estudada extensivamente através da ótica da fisiologia e da bioquímica (MOORE, 1995). Contudo, a análise da expressão dos transcritos das diferentes enzimas envolvidas no metabolismo da sacarose em diferentes estádios de desenvolvimento, tem sido muito pouco explorada em relação aos genes e às enzimas que participam do processo (VERMA et al., 2011).
Dessa forma, o objetivo geral do trabalho é avaliar quais os principais genes e proteínas envolvidas no processo de acumulação da sacarose no colmo de cana, além do comportamento metabólico das células do parênquima relacionadas à estocagem sacarose. Como objetivos específicos o trabalho visou:
• Quantificar os principais açúcares solúveis, glicose, frutose e sacarose, presente nas células do parênquima do colmo dos internós do topo (I4) até os internós da base (I9), e estabelecer uma relação entre a concentração desses açúcares e as variações na expressão dos transcritos das enzimas e proteínas envolvidas no metabolismo da sacarose;
• Acompanhar a evolução do perfil dos transcritos dos genes relacionados
diretamente à rota da sacarose nos internós imaturos (I5) e maduros (I9) em plantas de cana em diferentes estádios de desenvolvimento, 4 meses, 7 meses e 10 meses;
• Avaliar a participação dos transcritos dos genes das enzimas do processo de ciclagem e acumulação de sacarose em internós desenvolvidos (I9) nas idades de 7 e 10 meses, para diferentes concentrações de sacarose;
• Identificação das proteínas diferencialmente expressas no internó 9 das plantas
com 7 meses quando comparadas com o internó 9 das plantas de 10 meses. Identificar as proteínas preferencialmente expressas no internó 9 das plantas de 7 e 10 meses.
4 MATERIAL E MÉTODOS