Proteoma total

Após a otimização do protocolo de preparação da amostra e das condições da eletroforese Tabela 3. 1. Taxa específica de crescimento (µ) e tempo de duplicação (Td) da estirpe Streptomyces aculeolatus PTM-129

Taxa especifica de crescimento (h-1_{) Tempo de duplicação (h)}

0,0151 45,9

Figura 3.1. Curva de crescimento da estirpe Streptomyces aculeolatus PTM-129 em meio A1. Os valores apresentados respresentam a média de dois ensaios biológicos individuais e dois replicados técnicos.

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 50 100 150 200 P eso s ec o g /3 0 0 m l Tempo (horas)

à estirpe PTM-29 e 380 spots relativos à estirpe PTM-129, num intervalo pH 4-7. Note-se que estes valores representam a média de três replicados biológicos e dois replicados técnicos para cada uma das estirpes em questão. Foi possível ainda constatar a existência de uma grande abundância de proteínas de alto peso molecular, maioritariamente encontradas na gama de pH 5 – 6.

Apesar dos perfis 2D das diferentes estirpes em estudo serem bastante semelhantes entre si, com 203 spots comuns, dos quais 32 se encontram diferencialmente expressos nas duas estirpes (representados nas figuras 3.2 e 3.3), detetou-se igualmente um grande número de spots exclusivos de cada uma das estirpes: 246 spots exclusivos da estirpe PTM-29 e 176 spots exclusivos da estirpe PTM- 129 (exibidos nas figuras 3.4 e 3.5). Note-se que por diferencialmente expresso, entende-se todo o spot que apresentou uma razão entre os volumes relativos de spots correspondentes exibidos em diferentes classes, superior a 2.

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Figura 3.2. Mapa 2D do extrato proteico total da estirpe PTM-129 de S.aculeolatus. As proteínas foram separadas em strips de 11 cm de pH 4 – 7, seguido por eletroforese SDS-PAGE em géis de 12,5 % de acrilamida Os géis foram corados com azul coomassie coloidal. Os spots assinalados numericamente correspondem aos

spots de proteínas diferencialmente expressas nas duas estirpes. [imagem obtida no software Melanie 7.0.]

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A proximidade filogenética das estirpes em estudo, que apesar de pertencerem a diferentes filotipos, partilham 99% de identidade com base sequenciação do gene 16S rRNA, poderá explicar o as semelhanças observadas ao nível dos perfis 2D. Por outro lado, o facto de estas terem sido isoladas a partir de ambientes distintos, a estirpe PTM-29 isolada a partir de sedimentos recolhidos em mar aberto a 728 m de profundidade, enquanto que a estirpe PTM-129 foi isolada a partir de sedimentos recolhidos de areias superficiais na costa rochosa, a 15 m de profundidade, poderá ser a justificação mais plausível para o facto de apresentarem um grande numero de spots exclusivos e de alguns dos spots comuns entre ambas estarem diferencialmente expressos.

Ou seja, apesar de relacionadas filogeneticamente e de terem identidades muito próximas, a adaptação a diferentes ambientes, com condições extremas de pressão e temperatura, verificadas a altas profundidades, como é o caso da origem da estirpe PTM-29, poderá ter-se refletido ao nível do genoma desta estirpe, refletindo-se nas diferenças observadas nos proteomas destas bactérias e, por consequência, ao nível dos seus exoproteoma e metaboloma, como veremos na secção 3.2.2.

De facto, estas estirpes exibem perfis de bioatividade bastante discrepantes. Segundo os resultados obtidos em trabalhos que decorreram no âmbito do projeto “Tesouros Oceânicos”, a estirpe Figura 3.3. Mapa 2D do extrato proteico total da estirpe PTM-29 de S.aculeolatus. As proteínas foram separadas em strips de 11 cm de pH 4 - 7 seguido por eletroforese SDS-PAGE em géis de 12,5 % de acrilamida Os géis foram corados com azul coomassie coloidal. Os spots assinalados numericamente correspondem aos spots de proteínas diferencialmente expressas nas duas estirpes. [imagem obtida no software Melanie 7.0.]

Figura 3. 14. Mapa 2D do extrato proteico total da estirpe PTM-129 de S.aculeolatus. As proteínas foram separadas em strips de 11 cm de pH 4 - 7 seguido por eletroforese SDS-PAGE em géis de 12,5 % de acrilamida Os géis foram corados com azul coomassie coloidal. Os spots representados correspondem aos spots de proteínas diferencialmente expressas nas duas estirpes. [imagem obtida no software Melanie 7.0.]

Figura 3. 15. Mapa 2D do extrato proteico total da estirpe PTM-129 de S.aculeolatus. As proteínas foram separadas em strips de 11 cm de pH 4 - 7 seguido por eletroforese SDS-PAGE em géis de 12,5 % de acrilamida Os géis foram corados com azul coomassie coloidal. Os spots representados correspondem aos spots de proteínas diferencialmente expressas nas duas estirpes. [imagem obtida no software Melanie 7.0.]

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PTM-29 está envolvida na síntese de vários compostos pertencentes às famílias napiradiomicinas e marinonas, demonstrando atividades antibacterianas contra MRSA COL (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) e VRE EF82 (vancomycin - resistant enterococci) e atividade antifouling contra bactérias marinhas (Marinobacter hidrocarbonoclasticus e Cobetia marina) e larvas de mexilhão (Mytilus galloprovincialis). Quanto à estirpe PTM-129, embora ainda não se tenha realizado o fracionamento e isolamento dos compostos por HPLC, os testes biológicos realizados ao seu extrato bruto não revelaram qualquer tipo de bioatividade (Amendoeira 2016). Esta informação é bastante interessante, dada a proximidade filogenética das estirpes, tornando a estirpe PTM-129 um “modelo” para estudos proteómicos comparativos, uma vez que do seu metabolismo secundário não resultam, até à data, compostos bioativos. Desta forma a análise diferencial entre estirpes relacionadas em termos de filogenia com a referida estirpe, pode resultar na identificação de prováveis biomarcadores proteicos da síntese de metabolitos bioativos.

Neste contexto assume-se que os spots que se encontram sobrexpressos no proteoma da estirpe PTM-29 Streptomyces aculeolatus, bem como os spots exclusivos detetados na mesma estirpe PTM-29, exibidos na figura 3.4, representem possíveis biomarcadores envolvidos na síntese de metabolitos bioativos excretados por esta estirpe. Na secção 6.1, tabelas 6.1 e 6.2, são apresentados, de forma mais detalhada, dados relativos à análise diferencial dos proteomas totais das estirpes em estudo.

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Figura 3.4. Mapa 2D do extrato proteico total das estirpes PTM-29 de S.aculeolatus. As proteínas foram separadas em strips de 11 cm de pH 4 - 7 seguido por eletroforese SDS-PAGE em géis de 12,5 % de acrilamida Os géis foram corados com azul coomassie coloidal. Os spots assinalados a vermelho correspondem aos spots exclusivos de proteínas da estirpe PTM-29. [imagem obtida no software Melanie 7.0.]

Os spots referidos acima, foram selecionados para identificação através da técnica peptide mass fingerprint, uma vez que muito provavelmente, alguns destes corresponderão às proteínas envolvidas na síntese dos metabolitos bioativos encontrados no metaboloma da estirpe PTM-29, nomeadamente napiradiomicinas e marinonas.

A sequenciação recente da estirpe Streptomyces sp. CNQ-509, relacionada filogeneticamente com as estirpes em estudo (99% de identidade segundo dados obtidos no BLAST nucleotide), poderia, à partida, alargar as oportunidades de investigação da maquinaria biossintética, ao permitir correlacionar as evidências observadas ao nível do metaboloma-exoproteoma/proteoma com dados relativos ao genoma (Rückert et al. 2015). No entanto, com base neste estudo, ficou provado que a percentagem de identidade baseada na sequência do gene housekeeping 16S rRNA deve ser encarada apenas como critério taxonómico para estudos de filogenia, uma vez que estas percentagens não são representativas do genoma total das bactérias. Com efeito, tornou-se bem evidente neste estudo que, apesar das estirpes bacterianas em questão partilharem 99% de identidade, exibem grandes diferenças ao nível do seu Figura 3.5. Mapa 2D do extrato proteico total da estirpe PTM-129 de S.aculeolatus. As proteínas foram separadas em strips de 11 cm de pH 4 - 7 seguido por eletroforese SDS-PAGE em géis de 12,5 % de acrilamida Os géis foram corados com azul coomassie coloidal. Os spots assinalados a vermelho correspondem aos spots exclusivos de proteínas da estirpe PTM-129. [imagem obtida no software Melanie 7.0.]

Figura 3. 66. Mapa 2D do extrato proteico total da estirpe PTM-129 de S.aculeolatus. As proteínas foram separadas em strips de 11 cm de pH 4 - 7 seguido por eletroforese SDS-PAGE em géis de 12,5 % de acrilamida Os géis foram corados com azul coomassie coloidal. Os spots representados correspondem aos spots exclusivos de proteínas da estirpe PTM-129. [imagem obtida no software Melanie 7.0.]

Figura 3. 67. Mapa 2D do extrato proteico extracelular da estirpe PTM-29 de S.aculeolatus. As proteínas foram separadas em strips de 7 cm de pH 4 - 7 seguido por eletroforese SDS-PAGE em géis de 12,5 % de acrilamida Os géis foram corados com azul coomassie coloidal. Os spots representados correspondem aos spots comuns de proteinas sendo que os spots assinalados com os numeros 0, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 19, 20 e 21 encontram-se diferencialmente expressos nas duas estirpes. [imagem obtida no software Melanie 7.0.]Figura 3. 68. Mapa 2D do extrato proteico total da estirpe PTM-129 de S.aculeolatus. As proteínas foram separadas em strips de 11 cm de pH 4 - 7 seguido por eletroforese SDS-PAGE em géis de

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proteoma e, consequentemente, ao nível do seu metaboloma, o que só poderá resultar de diferenças ao nível genoma destas estirpes.

Assim, a descodificação dos genomas das estirpes em estudo, é de extrema relevância para que em ultima estância se possam cruzar dados ao nível do metaboloma-exoproteoma/proteoma/genoma, e assim descrever no seu todo, as vias envolvidas na biossíntese destes metabolitos.