PROTOCOLO DE PRESERVAÇÃO

O protocolo foi dividido em duas fases. Na fase I avaliamos os efeitos da criopreservação e da concentração do criopreservante sobre a viabilidade celular. Na fase II comparamos os efeitos do armazenamento em congelador, em geladeira e em estufa sobre a viabilidade celular, além da influência de modificações nos meios de armazenamento das amostras mantidas no congelador.

4.3.1 Procedimento comum às fases I e II

4.3.1.1 Procedimentos de congelamento

O congelamento foi feito em embalagem de Etileno Vinil Acetato (EVA). As amostras do congelamento a -70º C e do congelamento com nitrogênio líquido a -196º C da fase I foram armazenadas por 9 semanas e descongeladas por três minutos a 37º C. As amostras do congelamento a -70º C da fase II foram armazenadas por 1 ano e descongeladas da mesma forma que na fase I. Após o descongelamento, as amostras da fase I foram processadas para a análise de viabilidade celular e as amostras da fase II foram processadas para análise

histológica e ensaio de viabilidade celular. Nesse último, cada fragmento foi dividido em dois hemi cilindros do mesmo tamanho para serem submetidos às duas formas de análise.

4.3.2 Procedimento específico da fase I

4.3.2.1 Ensaios de sobrevivência

A viabilidade celular nos cortes histológicos foi analisada através de uma modificação do ensaio original de viabilidade celular (LIVE/DEAD®

Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells, InVitrogen do Brasil), onde as

células vivas são coradas com acetoximetilcalceína, e as células mortas são coradas em Brometo de Etídeo. Após a incubação dos cortes com os dois reagentes, os mesmos foram analisados em microscópio de fluorescência, através da contagem de células coradas em azul (células totais, DAPI) e de células coradas em vermelho (células mortas, brometo de etídeo). O DAPI difunde-se pela membrana ligando-se ao DNA de todas as células presentes no tecido. O brometo de etídio por ser impermeável à membrana, somente liga- se ao DNA das células com a membrana comprometida, pela qual consegue atravessar. O número de células vivas foi calculado pela diferença entre células totais e células mortas.

4.3.3 Procedimentos específicos da fase II

4.3.3.1 Processamento das amostras

Após o período de armazenamento (e imediatamente para as amostras do grupo controle) os fragmentos foram separados em porção óssea e porção cartilaginosa, sendo a primeira porção (óssea) descartada. Em cada protocolo

de preservação utilizou-se dois fragmentos de cada doador. Para a análise histológica convencional, por microscopia óptica, as amostras foram fixadas em formol 10% tamponado por 24 horas, desidratadas em álcool em crescentes concentrações, incluídas em parafina para a obtenção de cortes histológicos com 3 – 4 m de espessura e coradas pela técnica de Hematoxilina-Eosina ou Safranina.

4.3.3.2 Análise Histológica

Os cortes histológicos foram corados em Hematoxilina-Eosina (H&E) para análise global do tecido e pela técnica de Safranina, para avaliação das características da matriz extracelular cartilaginosa, em especial, a deposição de proteoglicanas. Os cortes foram analisados ao microscópio óptico e fotografados para registro dos resultados em aumento de 200X.

A análise histológica foi realizada conforme o protocolo de Mankin modificado (87), conforme apresentado na tabela 1.

4.3.3.3 Ensaios de sobrevivência

A viabilidade celular na fase II foi realizada nos condrócitos em suspensão através de uma modificação do ensaio original de viabilidade celular (LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells, InVitrogen do

Brasil), onde as células vivas são coradas com acetoximetilcalceína, e as

células mortas são coradas em Brometo de Etídeo, conforme descrito anteriormente.

Os fragmentos osteocondrais foram transferidos para um tubo de 50 mL e lavados em CMF, duas a três vezes, para remoção de sangue e gordura.

Após a lavagem, com auxílio de pinça e bisturi, em placa de Petri, a cartilagem foi separada dos fragmentos e seccionada em fragmentos de, aproximadamente, 1mm3. Os fragmentos foram transferidos para um frasco estéril e incubados com colagenase 2,5% por 18 horas, a 37ºC, sem homogeneizar. Após o período de incubação, a suspensão celular foi homogeneizada com auxílio pipeta Pasteur. A suspensão celular foi transferida para um tubo de 50 mL e foi adicionado o mesmo volume de Meio Iscove’s contendo 10% de soro fetal bovino. A suspensão celular foi centrifugada, o sobrenadante descartado e as células suspensas em Meio Iscove’s contendo 10% de soro fetal bovino e plaqueadas em garrafas de cultura na proporção de 100 mg/cm2.

Após isolamento dos condrócitos, estes foram incubados por 30 minutos após adição do brometo de etídio para coloração das células mortas, conforme descrito anteriormente. Terminado este período de tempo, a solução contendo os condrócitos em meio era centrifugada em citocentrífuga de forma a concentrar o material celular na lâmina para análise. Estando pronta a lâmina, o DAPI era adicionado para coloração de todas as células.

4.3.4 Grupos experimentais

Os fragmentos osteocondrais foram divididos nos seguintes grupos experimentais:

4.3.4.1 Grupos experimentais da fase I

a) Grupo Controle (C1): Os fragmentos foram analisados histologicamente imediatamente após a coleta, para contagem de células e estabelecimento do padrão de comparação para os demais grupos.

b) Grupos Congelamento Gradual a -196ºC (2A-1 e 2B-1): Os fragmentos foram divididos em 2 subgrupos e congelados lentamente em resfriador gradual a -1oC/minuto até -40oC, -2oC/minuto até -60oC, -5oC/minuto até - 150oC, e posteriormente em nitrogênio líquido a -196oC e mantidos por 9 semanas. No grupo 2A-1 os fragmentos foram mantidos em meio Iscove’s contendo 10% de Dimetil Sulfóxido (DMSO), 10% de albumina humana e 2mM de Glutamina; no grupo 2B-1, os fragmentos foram mantidos em meio Iscove’s contendo 20% de DMSO, 10% de albumina humana e 2mM de Glutamina;

c) Grupo Congelamento Rápido a -70ºC (3-1): Os fragmentos foram congelados diretamente em congelador a -70º C em meio Iscove’s contendo 10% de albumina humana e mantidos por 9 semanas.

4.3.2 Grupos experimentais da fase II

a) Grupo Controle (C2): Os fragmentos foram analisados logo após a coleta para contagem de células e estabelecimento do padrão de comparação para os demais grupos;

b) Grupo Estufa (E-1, E-3, E-7 e E-14): Os fragmentos foram mantidos em meio Iscove’s suplementado com albumina humana e analisados com 1, 3, 7 e 14 dias (E-1, E-3, E-7 e E-14, respectivamente) após permanecerem em estufa de CO2 a 37ºC. A cada três dias foi feita a troca do meio.

c) Grupo Refrigeração a 4oC (R-1, R-3, R-7 e R-14): Os fragmentos foram mantidos em meio de Iscove’s suplementado com albumina humana e analisados com 1, 3, 7 e 14 dias (R-1, R-3, R-7 e R-14, respectivamente) após permanecerem em refrigeração a 4ºC em uma refrigerador doméstico.

d) Grupo Congelamento a -70ºC (4A, 4B, 4C): Os fragmentos foram divididos em 3 subgrupos e congelados gradualmente a -1º C/min até -70º C e mantidos armazenados por um ano. No grupo 4A os fragmentos foram mantidos em meio Iscove’s contendo 10% de Dimetil Sulfóxido (DMSO); no grupo 4B, os fragmentos foram mantidos em meio Iscove’s contendo 10% DMSO e 10% de albumina humana; e no grupo 4C, os fragmentos foram mantidos em meio Iscove’s contendo 10% DMSO, 10% de albumina humana e Dextrose.