Protocolo experimental e de avaliação comportamental

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No DPN 55, três machos e três fêmeas de cada ninhada foram escolhidos aleatoriamente e identificados para posterior exposição a uma bateria de testes comportamentais, cujos procedimentos estão descritos abaixo. Um macho e uma fêmea restantes de cada ninhada não foram expostos a qualquer teste comportamental e foram mantidos em sua gaiola-moradia até o fim dos experimentos, sendo eutanasiados no mesmo dia que seus irmãos, para obtenção de material biológico que foi utilizado para a determinação de valores basais de CORT e monoaminas cerebrais. Todos os testes comportamentais foram realizados entre 8:00 h e 10:00 h para os machos e entre 10:00 h e 12:00 h para as fêmeas. Cada animal testado passou por todos os testes descritos a seguir e a fim de amenizar o efeito das manipulações aos quais os animais são submetidos em cada teste, optou-se por um intervalo de aproximadamente uma semana entre um teste e outro.

3.2.1. Novelty Supressed feeding

O NSF é um modelo animal utilizado para avaliar o comportamento do tipo-ansioso; porém, por valer-se do estado motivacional do animal, pode ser empregado para avaliar o perfil depressivo (Powell et al., 2012). Este teste utiliza, como paradigma central, a situação de conflito entre a fome e a aversão a locais novos e abertos (Bodnoff et al., 1988).

Quatro dias antes do início do teste, os animais foram alojados individualmente, para avaliação de consumo alimentar diurno e noturno. Para tanto, foi oferecida uma quantidade conhecida de ração pela manhã (9:00 h); às 17:30 h, a ração remanescente foi pesada e subtraída da quantidade inicial, fornecendo uma estimativa de consumo diurno. No dia seguinte (às 9:00 h) foi realizada nova pesagem da ração para estimar o consumo noturno. Também foi contabilizado o consumo cumulativo de ração (soma do peso de ração consumida

no 1º e 2º dias de estimativa, independente do período diurno ou noturno). No 3o e 4o dias, os

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pela busca por ração. Completado o período de privação alimentar, o teste foi conduzido com a presença do experimentador, em sala climatizada e com iluminação semelhante ao do biotério. Uma caixa de polipropileno (110 x 60 x 40 cm) foi colocada no centro da sala de experimento, de modo que permanecesse homogeneamente iluminada e sem presença de sombras. Um pellet de ração foi colocado no centro e o animal em uma das extremidades da caixa, com o focinho voltado para o pellet. Durante os 10 min do teste foram contabilizadas a latência para a primeira mordida e a quantidade de ração consumida. Ao término deste período, o rato voltou à caixa-moradia onde estava alojado individualmente e foi mantido por 30 min com fornecimento de água e ração à vontade, em sala sob as mesmas condições ambientais do biotério para avaliação do consumo alimentar, de modo que se pudesse determinar se qualquer alteração observada no novo ambiente foi devida à novidade ou à falta de motivação para se alimentar. Ao fim dos 30 min pós-teste, os animais retornaram às suas gaiolas-moradia, nos grupos originais. Este teste foi realizado entre os DPNs 67 e 74.

3.2.2. Testes de contraste positivo e negativo de sacarose

Para testar a resposta de consumo a uma súbita diferença de concentração de solução palatável de sacarose, dois frascos idênticos foram fornecidos aos ratos, alojados individualmente, durante três dias. Um dos frascos continha 200 ml de solução de sacarose e o outro, o mesmo volume de água. Em cada dia do teste os lados dos frascos foram invertidos para evitar o efeito de preferência pelo lado. A cada 24 h os frascos foram pesados para estimar o consumo de líquido.

Contraste Positivo: nos dois primeiros dias do teste a concentração de sacarose

oferecida foi de 5% e no terceiro dia, foi de 15% (Matthews et al., 1996). O total de 11 ninhadas foi submetido a este teste (veja n/grupo em resultados).

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Contraste Negativo: nos dois primeiros dias do teste a concentração de sacarose

oferecida foi de 15% e no terceiro dia foi de 2,1% (Matthews et al., 1996). O total de 22 ninhadas foi submetido a este teste (veja n/grupo em resultados).

Durante os três dias de teste os animais permaneceram alojados individualmente em uma sala sob as mesmas condições ambientais do biotério. Ao fim do último dia de teste, todos os animais retornaram às suas gaiolas-moradia originais.

O índice de preferência por sacarose foi determinado pelo cálculo da porcentagem de consumo da solução de sacarose em relação ao consumo total de líquidos, de acordo com a equação: Índice de preferência de sacarose = [ingestão de solução de sacarose / (ingestão de solução de sacarose + ingestão de água)] *100. Estes testes foram realizados entre os DPNs 75 e 84.

3.2.3. Investigação social

Este modelo animal é utilizado para avaliar a redução ou aumento do interesse pela exploração e investigação de outros indivíduos da mesma espécie e sexo (modificado de Landauer e Balster, 1982) e pode servir para avaliar aspectos de comportamentos de ansiedade social (File e Seth, 2003). O teste foi conduzido em uma arena circular com raio de 80 cm, cercada por parede de 50 cm de altura, com linhas de demarcações concêntricas no assoalho e presença de dois cestos metálicos com paredes vazadas (18,5 cm de diâmetro menor, 23,5 cm de diâmetro maior e 27 cm de altura), posicionados em lados opostos da arena e rodiziados a 90º a cada novo animal exposto ao teste. As sessões no aparato foram conduzidas em sala climatizada e sob iluminação semelhante ao do biotério. O experimentador permaneceu fora da sala de avaliação e o teste foi gravado por sistema de vídeo.

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No dia anterior ao teste houve uma pré-exposição do animal à arena (10 min), para habituação. No dia do teste (24 h após a habituação), cada animal foi colocado no centro da arena, com o focinho voltado para qualquer lado que não fosse um dos compartimentos presentes no ambiente, para explorar o ambiente e os compartimentos por 10 min. Um dos compartimentos com paredes vazadas permaneceu vazio, enquanto que o segundo continha um rato-alvo, do mesmo sexo e aproximadamente mesma idade, desconhecido ao animal experimental. Em ambos os dias os animais foram levados à sala de experimentação em uma caixa de polipropileno forrada com sabugo. A análise foi realizada pela contabilização da duração, em segundos, da exploração dos compartimentos vazio e com o rato-alvo, e desse modo calculamos a porcentagem de exploração do compartimento contendo o rato-alvo em relação ao tempo total de exploração de ambos os compartimentos. Este teste foi realizado entre o DPN 84 e 95.

3.2.4. Labirinto em cruz elevado

O LCE é um aparato utilizado para avaliar o comportamento do tipo-ansioso, baseado no paradigma central do medo inato de ratos por lugares altos e abertos, conforme proposto por Pellow et al. (1985). Foi utilizado um LCE feito de madeira, constituído por dois braços abertos (50 x 10 cm) e dois braços fechados (50 x 10 x 40 cm), de forma que os fechados são perpendiculares aos abertos. O conjunto estava elevado a 50 cm do piso. Os braços abertos eram delimitados por uma proteção de madeira medindo 5 cm de altura, com o propósito de evitar a queda dos animais. O assoalho do labirinto possuía marcações com linhas pretas que se espaçam a 10 cm uma da outra, que delimitavam segmentos e permitiam avaliar a atividade motora dos animais. O teste foi realizado sob iluminação de 75 lux e gravado por sistema de vídeo, sendo posteriormente analisado com o auxílio do programa X-plo-Rat (SP - Brasil, 2005). Este teste foi realizado entre os DPNs 92 e 105.

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Os animais foram avaliados por um período de 5 min e o critério considerado para entrada em um braço ou no centro foi a passagem completa das quatro patas do animal para o outro quadrante. Os resultados foram expressos em porcentagem de entradas e de tempo de permanência nos braços abertos (BA) em relação ao total de entradas e de tempo, respectivamente, de modo que quanto maior for a porcentagem de entradas e de tempo despendido nos braços abertos, menor é o comportamento do tipo-ansioso. Foram contabilizados ainda o número de segmentos percorridos em cada braço, o tempo de permanência no centro e o tempo de permanência na extremidade dos braços abertos. Também incluímos o índice de ansiedade (Mazor et al., 2009), que representa a exploração dos braços abertos, conforme a fórmula a seguir:

Índice de ansiedade = 1 − [

(_{Tempo total de teste}Tempo nos BAs ) + (n° de entradas nos BAs_{n° total de entradas} )

2 ]

de modo que quanto maior for o índice, maior é o nível de ansiedade do animal.