Protocolo experimental

Foram utilizados coelhos machos Nova Zelândia brancos, com massa corporal entre 2,0 a 3,5 Kg. Durante a experimentação, os animais foram mantidos no biotério da Cirurgia Experimental ou da Bioengenharia da FMRP-USP, sem ruídos e com iluminação e temperatura apropriadas (45).

Os animais foram alojados em caixas com fio galvanizado de ferro (diâmetro do fio de 3 mm), com 50 cm de largura, 60 cm de comprimento e 50 cm de altura, com base fenestrada para recolhimento dos seus excrementos. Foram fornecidas ração e água potável ad libitum. A limpeza das caixas foi feita diariamente. Todos os animais foram recebidos no biotério da Cirurgia Experimental ou da Bioengenharia e ficaram alojados por três dias antes do início do experimento para que pudessem se habituar ao ambiente. Os coelhos foram divididos em cinco grupos:

1) Grupo controle sem cirurgia (naive);

2) Grupo controle sensibilizado à OVA (controle OVA - com resposta alérgica);

3) Grupo teste exposto à SEB; 4) Grupo teste exposto ao LPS; 5) Grupo teste exposto ao LTA.

Os coelhos do grupo controle sem cirurgia (n=4) foram mantidos no biotério por oito semanas e em seguida foram eutanasiados. Os demais foram sensibilizados com injeção subcutânea de 1 mL de solução salina contendo 2,5% de OVA (Sigma- Aldrich) e 0,4% de hidróxido de alumínio (Sigma-Aldrich) nos dias 0 e 7. No 14º dia

de experimento, foram submetidos a procedimento cirúrgico para exposição do seio maxilar direito e implantação de cateter de polipropileno para irrigação.

Para realização do procedimento, os coelhos foram anestesiados com 5 mg/kg de xilazina (Horlândia-SP, Rhobifarma) (20 mg/mL de relaxante muscular) e 30 mg/kg de cloridrato de dextrocetamina (Horlândia-SP, Rhobifarma) (50 mg/mL de anestésico geral) intramuscular (IM) na região do quadríceps e região posterior da coxa, utilizando-se agulhas 25x8 mm (45). Um acesso venoso na orelha foi mantido para administração de tiopental sódico (Thiopentax®, Itapira-SP, Cristália), a fim de se manter a sedação (25mg/ml - 1 a 2 mL a cada 15 a 20 minutos) (45). Trata-se de um barbitúrico de curta duração que causa sonolência, sedação e hipnose. Após, receberam dose dobrada (0,6 mL) de antibioticoterapia IM (Pentabiótico® veterinário pequeno porte, São Paulo-SP, Eurofarma) (cada ampola de 3 mL contendo benzilpenicilina benzatina 600000 UI, benzilpeniciloina procaína 300000 UI, benzilpenicilina potássica 300000 UI, diidroestreptomicina base 250 mg e estreptomicina base 250 mg) e foram mantidos em ventilação espontânea, sem necessidade de intubação traqueal.

Após anestesia, foi realizada assepsia com PVPI (Polivinil Pirrolidona Iodo) tópico, infiltração do dorso com 1 mL de lidocaína 2% + adrenalina 1:200.000, com incisão do dorso nasal, verticalmente, de aproximadamente 3 cm (Figura 1A). Um retalho de periósteo foi confeccionado mantendo fixado no lado direito do dorso nasal (Figura 1B), sendo realizada, a seguir, uma abertura na face anterior do seio maxilar direito de aproximadamente 3x3 mm (Figura 1C). A mucosa do seio maxilar foi aberta com lâmina de bisturi, e por meio desta abertura foi realizada lavagem do seio para coleta de material para cultura (Figura 1D). Em seguida, um cateter de polipropileno (10,5 cm comprimento e 2,3 mm de diâmetro) foi posicionado a 0,2 mm no interior do seio maxilar direito. O cateter para irrigação sinusal foi transfixado subcutaneamente por um trocater no dorso nasal com saída entre as orelhas (Figura 1E). Este cateter foi fixado com cola instantânea (Super Bonder®) no osso, ancorado e recoberto em alça de periósteo (Figura 1F) e suturado na pele com nylon 4-0 (Figura 1G). A patência do cateter foi verificada pela instilação de 5 mL de soro fisiológico e verificação de saída de líquido pela narina direita. As incisões criadas

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foram fechadas por planos, utilizando-se vycril 3-0 para fechamento do plano periosteal e nylon 4-0 para fechamento do plano cutâneo (Figura 1H) (53).

Figura 1 - Cirurgia para exposição do seio maxilar direito e implantação de cateter para irrigação: (A) incisão vertical em dorso nasal, (B) confecção de retalho de periósteo, (C) abertura brocada na face anterior do seio maxilar direito, D) lavagem de seio maxilar direito para coleta de material para cultura, (E) trocater em dorso nasal para transfixação de cateter com abertura entre as orelhas, (F) cateter posicionado na abertura do seio maxilar, ancorado em alça de periósteo, (G) sutura de periósteo sobre cateter, (H) sutura de pele com abertura do cateter localizado entre as orelhas

Após conclusão do procedimento cirúrgico, os animais foram colocados em suas gaiolas para a recuperação anestésica, em local silencioso e com pouca luz e pesados semanalmente para monitorização de ganho de peso. No quinto dia após a cirurgia, os coelhos receberam a segunda dose de antibioticoterapia IM (0,6 mL).

Durante as duas semanas de pós-operatório, o seio maxilar direito foi irrigado com 0,5 mL de OVA 2,5% (diluída em diluída em solução fisiológica), três vezes por semana. Em seguida, os coelhos foram selecionados em cada grupo por meio de sorteio. Como existia restrição de gaiolas nos biotérios, cada experimento foi realizado em média com seis coelhos, sendo um coelho pelo menos do grupo controle OVA. A seguir, os animais foram abordados de acordo com a alocação em cada grupo (Figura 2):

- Grupo B (controle OVA): administração intrassinusal de 0,5 mL de solução de tampão fosfato salino (PBS) 3x/semana, por quatro semanas seguidas;

- Grupo C (SEB) (Sigma-Aldrich): administração intrassinusal de 0,5 mL de solução de PBS contendo 1 μg/mL de SEB, 3x/semana, por quatro semanas seguidas (32);

- Grupo D (LPS) (Sigma-Aldrich): administração intrassinusal de 0,5 mL de solução de PBS contendo 100 ng/mL de LPS de E. coli, 3x/semana, por quatro semanas seguidas (26, 27);

- Grupo E (LTA): administração intrassinusal de 0,5 mL de solução de PBS contendo 100 ng/mL de LTA (Sigma-Aldrich) purificado de

Streptococcus pyogenes (S. pyogenes), 3x/semana, por quatro

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Figura 2 - Representação esquemática do protocolo experimental

Vinte e quatro horas após a última administração intrassinusal, os coelhos foram sacrificados por injeção endovenosa de tiopental (5 mL de solução 25 mg/mL) (45,54). Após confirmação de óbito do animal, a região nasal anterior foi dissecada, sendo coletado lavado de seio maxilar direito pelo óstio aberto em dorso nasal para cultura. Após ampla exposição da parede anterior do seio maxilar, a parede medial do seio maxilar foi removida e processada para análise histopatológica (Figura 3). Os mesmos passos foram realizados no seio maxilar esquerdo para extração de tecido nasossinusal não irrigado como parâmetro de controle.

Figura 3 - (A) Dissecção da região nasal anterior com exposição do cateter de irrigação sinusal, (B) Parede anterior do seio maxilar brocado, (C) Exposição da parede medial do seio maxilar direito, (D) Remoção da parede medial do seio maxilar direito para avaliação histopatológica

Para análise histopatológica, as amostras foram fixadas em formalina tamponada a 10%, por 24h, a 4°C. Em seguida, o material foi desidratado em uma série crescente de etanol (50% a 100%), diafanizado em xilol e embebido em parafina a 60°C para posterior inclusão em blocos. Foram realizados cortes de 6 µm de espessura em micrótomo Leica Jung RM2065 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemanha) e preparados sobre lâminas de vidro silanizado StarFrost (Knittel Glass). As lâminas passaram por desparafinação em xilol, reidratação em série decrescente de etanol, lavagem em água destilada e coloração por Hematoxilina e eosina (HE) e Giemsa.

Para HE, os cortes foram corados em solução de Hematoxilina por 1,5 minutos, lavados em água corrente, corados em Eosina por dois minutos, imersos em etanol acetificado por dois minutos. Posteriormente, as lâminas foram desidratadas em série crescente de etanol até 100%, diafanizadas em xilol e montadas com Tissue Mount (Tissue Tek® Glas™ Mounting Media, Sakura, Finetek USA). Para Giemsa, as lâminas foram fixadas em álcool metílico por três minutos, coradas com solução Giemsa por 20 minutos e lavadas em água corrente por 10 minutos. Em seguida, as lâminas foram colocadas para secar em estufa a 60°C,

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imersas em banho rápido de xilol e montadas com Permount (Fisher Chemical™ Permount™ Mounting Medium, Fischer Scientifics, New Jersey, USA)

As imagens das lâminas foram adquiridas em aumento de 40x, utilizando-se um sistema VS120 da Olympus em um microscópio BX61 do Laboratório Multiusuário de escaneamento de lâminas (LMEL), pertencente ao Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patógenos da FMRP-USP (17). Foram realizadas as seguintes avaliações:

1- Espessura epitelial- Realizada uma medida da espessura epitelial a cada 400 µm, quantas medidas fossem possíveis, e depois calculada a média (Figura 4) (55).

2- Espessura subepitelial- Realizada uma medida da espessura subepitelial a cada 400 µm, quantas medidas fossem possíveis, e depois calculada a média (55).

3- Infiltrado celular epitelial por eosinófilo, neutrófilo, linfócito, plasmócito e mastócitos. Tais células foram diferenciadas segundo as características citológicas (Tabela 1 e Figura 5) (56). Em cada terço da amostra foi selecionada uma área epitelial de 200 µm de extensão onde foi computado o número de cada tipo de célula. Quando houve dúvida, a lâmina também foi analisada com coloração Giemsa. A média foi expressa em número total de células por 200 µm de epitélio.

4- Infiltrado celular subepitelial por eosinófilo, neutrófilo, linfócito, plasmócito e mastócitos- Tais células foram diferenciadas de acordo com as características citológicas (Tabela 1 e Figura 5) (56). Em cada terço da amostra foi selecionada uma área subepitelial de 10000 µm2 (100 µm x 100 µm), logo abaixo do epitélio (17), onde foi computado o número de cada tipo de célula infiltrada. Quando houve dúvida, a lâmina também foi analisada com coloração Giemsa. A média foi expressa em número total de células por 10000 µm2 (55).

5- Infiltrado celular epitelial total- Em cada terço da amostra foi selecionada uma área epitelial de 200 µm de extensão, onde foi quantificado o número de células infiltradas (eosinófilo, neutrófilo, linfócito, plasmócito

ou mastócitos). Da mesma forma, em casos de dúvida, cortes histológicos sequenciais foram corados com Giemsa para fins comparativos. A média foi expressa em número total de células por 200 µm de epitélio.

6- Infiltrado celular subepitelial total- Em cada terço da amostra foi selecionada uma área subepitelial de 10000 µm2 (100 µm x 100 µm), logo abaixo do epitélio (17), onde foi computado o número de células infiltradas (eosinófilo, neutrófilo, linfócito, plasmócito ou mastócitos). A média foi expressa em número total de células por 10000 µm2 (55). 7- Porcentagem de desepitelização- A cada 400 µm foi calculada a

porcentagem de desepitelização, quantas medidas forem possíveis, e depois calculada a média (55).

Figura 4 - Representação esquemática das medidas realizadas nas avaliações histológicas em lâminas coradas com hematoxilina-eosina

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Tabela 1 - Características das células identificadas em áreas epiteliais e subepiteliais (56)

Célula Características

Neutrófilo Núcleos formados por dois a cinco lóbulos (3 lóbulos normalmente) e citoplasma claro com grânulos pequenos.

Eosinófilo Mesmo tamanho dos neutrófilos com núcleo bilobulado e granulações grosseiros que se coram intensamente com eosina. Grânulos maiores que os dos neutrófilos. Mastócito Célula globosa, grande, com citoplasma repleto de grânulos, núcleo pequeno,

esférico e central.

Linfócito Células pequenas, com citoplasma muito escasso e núcleo escuro e esférico.

Plasmócito Células grandes e ovoides de citoplasma basófilo e com complexo de Golgi e centríolos próximos do núcleo que se apresentam como área mais clara nas colorações mais comuns. Núcleo esférico, excêntrico e com grumos de cromatina.

Figura 5 - Exemplos de células avaliadas nos compartimentos epitelial e subepitelial: (A) eosinófilo, (B) neutrófilo, (C) linfócito, (D) plasmócito, (E) mastócito, (F) exemplo de área com visualização de eosinófilos, neutrófilos, linfócitos e plasmócitos

8- Porcentagem de células caliciformes- Em cada terço da amostra foi selecionada uma área com 200 µm de extensão de epitélio, calculada a porcentagem de células caliciformes e depois calculada a média (Figura 6) (16);

9- Epitélio ciliado- Em toda a extensão da amostra foi avaliada a presença de cílios e categorizada em ‘0’ se normal, ‘1’ se ausência de cílios leve/focal (menos de 50%), ‘2’ se moderada/difusa (mais de 50%) e ‘3’ se acentuada/extensa (100%) (Figura 7) (57).

Figura 6 - Porcentagem de células caliciformes: (A) exemplo com 0% de células caliciformes, (B) exemplo com 5% de células caliciformes, (C) exemplo com 10% de células caliciformes, (D) exemplo com 25% de células caliciformes

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Figura 7 - Classificação de epitélio ciliado: (A) categoria 0 com presença normal de cílios, (B) categoria ‘1’ com perda leve/focal de cílios, (C) categoria ‘2’ com perda moderada/difusa de cílios, (D) categoria ‘3’ com perda acentuada/extensa de cílios

10- O grau de edema, fibrose e de tecido glandular subepitelial (Figuras 8, 9 e 10) e de metaplasia escamosa do epitélio foi categorizado em ‘0’ se normal, ‘1’ se leve/focal, ‘2’ se moderada/difusa e ‘3’ se acentuada/extensa (16).

Figura 8 - Classificação de edema subepitelial: (A) categoria ‘0’ sem edema, (B) categoria ‘1’ com edema leve/focal, (C) categoria ‘2’ com edema moderado/difuso, (D) categoria ‘3’ com edema acentuado/extenso

Figura 9 - Classificação de fibrose subepitelial: (A) categoria ‘0’ sem fibrose, (B) categoria

‘1’ com fibrose leve/focal, (C) categoria ‘2’ com fibrose moderada/difusa, (D) categoria ‘3’ com fibrose acentuada/extensa

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Figura 10 - Classificação de tecido glandular subepitelial: (A) categoria ‘0’ sem aumento de

tecido glandular, (B) categoria ‘1’ com aumento de tecido glandular leve/focal, (C) categoria ‘2’ com aumento de tecido glandular moderado/difuso, (D) categoria ‘3’ com aumento de tecido glandular acentuado/extenso

11- Contagem de pólipos- Ao longo de todas as amostra de mucosa foi verificada a existência de pólipos definidos como elevação do epitélio e subepitélio em direção ao seio, mantendo regular a linha de base do periósteo.

As avaliações foram realizadas por dois observadores de forma cega (16,34,35,58). Quando houve discordância maior de cinco células ou maior que uma categoria em cada avaliação, foi realizada reunião entre os dois observadores para se definirem as medidas em comum acordo.