Protocolo para avaliar os efeitos dos pHs (7,4 e 6,0) nas contrações induzidas por

Como os protocolos para o CCh assim como para a 5-HT são semelhantes, a seguir serão abordados os passos realizados para os protocolos de cada agonista, porém cada procedimento foi realizado em grupos e tecidos distintos.

Os tecidos banhados em meios com pHs (7,4 ou 6,0) foram estimulados com concentrações crescentes de CCh (0,01 – 100µM) (Figura 9) ou 5-HT (0,001 – 100µM) (Figura 10). Além dessa curva, os tecidos foram submetidos à novas curvas concentração- efeito, porém, aqueles anteriormente banhados em meio com pH 7,4 passaram ao meio com pH 6,0, e vice-versa.

Figura 9 – Curvas concentração-efeito ao CCh em meios com pHs (7,4 ou 6,0).

Fonte: Elaborado pelo autor.

Figura 10 – Curvas concentração-efeito ao 5-HT em meios com pHs (7,4 ou 6,0).

4.5.5 Protocolo para avaliar a participação de canais do tipo VOCC na contratilidade de tiras de tecido de fundo de estômago banhados em soluções com diferentes pHs.

Após a montagem dos tecidos no sistema de banho para órgãos isolados, os mesmos passaram pelo período de estabilização e posterior teste de viabilidade dos tecidos como foi descrito nas sessões anteriores (4.3 e 4.4). Em seguida, a solução da câmara onde os tecidos eram banhados foi trocado por uma solução de mesma composição, porém sem a adição de Ca²+ e com adição de EGTA (0,5mM), um quelante de cálcio, assim como tiveram o pH ajustado em 7,4 ou 6,0. Daí então, seguiu-se da adição de KCl (60mM) para estimular a abertura dos canais do tipo VOCC e, após cinco minutos, deu-se início a uma curva de Ca²+ (0,1 a 10mM) (Figura 11). Para certificar que a estimulação com KCl (60mM) estimulou a abertura apenas dos canais VOCC, foi realizado um outro protocolo com adição de verapamil (10µM), um antagonista dos canais VOCC, antes da estimulação com o KCl (60mM) (Figura 12).

Figura 11 – Protocolo para avaliar participação dos canais do tipo VOCC na contratilidade de tecidos de fundo de estômago em meio com soluções com diferentes pHs.

Figura 12 – Protocolo de bloqueio dos canais do tipo VOOC pelo verapamil (10µM).

Fonte: Elaborado pelo autor.

4.5.6 Protocolo para avaliar a participação de canais do tipo ROCC na contratilidade de tiras de tecido de fundo de estômago banhados em soluções com diferentes pHs (7,4 ou 6,0).

Após a montagem dos tecidos no sistema de banho para órgãos isolados, os mesmos passaram pelo período de estabilização e posterior teste de viabilidade como foi descrito nas sessões anteriores (4.3 e 4.4). Em seguida, a solução da câmara onde os tecidos foram mantidos foi trocada por uma solução com o pH ajustado em 7,4 ou 6,0 de mesma composição, exceto pela ausência de Ca²+ e adição de EGTA (0,5mM). Em seguida, foi adicionado verapamil (10µM), bloqueador dos canais VOCC e, após um período de cinco minutos, adicionou-se CCh (30µM) na câmara, para estimular a abertura dos canais ROCC. Daí então foi realizado uma curva de Ca²+ (0,1 a 10mM) (Figura 13).

Para certificar que a adição do verapamil na concentração de (10µM) foi efetiva no bloqueio dos canais do tipo VOCC foram realizados dois protocolos semelhantes ao descrito anteriormente. Porém, ao invés de realizar uma curva de Ca²+, dessa vez foi realizado uma curva de Ba2+ (0,1 a 10 mM), um íon permeável aos canais do tipo VOCC, porém não permeável aos canais do tipo ROCC. Primeiramente foi realizado um protocolo para demonstrar que o CCh é capaz de estimular a abertura de ambos os canais. Para tanto, os tecidos foram mantidos em meio sem Ba2+, com posterior adição de CCh (30µM) para estimular a abertura dos canais ROCC e VOCC e, em seguida, o Ba2+ foi adicionado em concentrações crescentes (0,1 a 10 mM), (Figura 14). Em outro protocolo foi realizado procedimento semelhante, porém com adição prévia de verapamil (10µM) antes da adição de CCh (30µM) e posterior realização da curva de Ba2+ (Figura 15).

Figura 13 – Protocolo para avaliar a participação dos canais do tipo ROCC na contratilidade de tecidos de fundo de estômago em meio com soluções de diferentes pHs (7,4 ou 6,0).

Fonte: Elaborado pelo autor.

Figura 14 – Protocolo de curva concentração-efeito ao Ba2+ com estímulo prévio de CCh (30µM).

Fonte: Elaborado pelo autor.

Figura 15 – Protocolo de inibição dos canais VOCC com adição de verapamil 10µM na curva de Ba2+ com estímulo prévio com CCh (30µM).

4.5.7 Protocolo para avaliar a resposta contrátil em tecidos de fundo de estômago estimulados pela entrada de cálcio via canais do tipo SOCC em meio com soluções de diferentes pHs (7,4 ou 6,0).

Primeiramente, os tecidos de fundo de estômago foram mantidos em meio sem Ca²+ e estimulados consecutivamente por adição de CCh 10 µM para efetuar o esgotamento de cálcio do retículo sarcoplasmático estimulando a abertura dos canais SOCCs. Posteriormente, após identificar que a magnitude da resposta contrátil não foi diferente da anterior, as soluções das preparações foram novamente trocadas por soluções sem Ca²+, com EGTA 1mM e com os pHs ajustado em 7,4 ou 6,0. Seguiu-se então com adição de tapsigargina (1µM) nas preparações, um inibidor da SERCA utilizado como ferramenta farmacológica para estimular a abertura do cais SOCCs e, após cinco minutos, foram adicionadas concentrações crescentes Ca²+ (0,1 a 10mM) (Figura 16).

Em um protocolo adicional, foi utilizada a mesma sequência de procedimento, porém desta vez, após adição de tapsigargina 1µM foi adicionado uma única concentração de Ca2+ (5mM) para estimulo contrátil. E então, foi esperando que as contrações dos tecidos chegassem a um platô, para assim adicionar concentrações crescentes do SKF 96365 (3 – 50 µM), um inibidor de canais SOCCs (Figura 17).

Figura 16 – Protocolo para avaliar o papel dos canais do tipo SOCC em tecidos banhados em soluções com diferentes pHs (7,4 ou 6,0).

Figura 17 – Protocolo com inibição de canais SOCC pelo SKF 96365 em meios com pHs (7,4 ou 6,0).

Fonte: Elaborado pelo autor.

4.5.8 Protocolo para avaliar o decaimento dos níveis de Ca2+ do retículo sarcoplasmático via IP3 em tecidos de fundo de estômago em meio com diferentes pHs (7,4 ou 6,0).

Após a montagem dos tecidos de fundo de estômago no sistema de banho para órgãos isolados, os mesmos passaram pelo período de estabilização e posterior teste de viabilidade do tecidual. Em seguida, os tecidos nas preparações com Ca²+ foram estimulados por adição de CCh (10µM) para obter uma resposta contrátil controle (normalização dos dados). Em seguida, a solução foi trocada por soluções com pHs ajustado em 7,4 ou 6,0 sem a presença de Ca²+ e contendo EGTA (1mM). Posteriormente foi adicionado CCh (10µM) com uma posterior troca de solução que se repetiu até que a liberação de cálcio pelos estoques do retículo não fosse suficiente para deflagrar uma contração de mesma magnitude que a anterior (Figura 18).

Figura 18 – Protocolo para avaliar o decaimento dos níveis de Ca²+ do retículo sarcoplasmático via IP3.

Fonte: Elaborado pelo autor.

4.4.9 Protocolo para avaliar a ação de tirosinas cinases em tecidos de fundo de estômago banhados em meios com pHs (7,4 ou 6,0).

Para avaliar os efeitos da acidose extracelular na resposta contrátil estimulada pela ação de proteínas tirosinas cinases em tiras de tecidos de fundo de estômago de ratos foi utilizado um inibidor de proteínas tirosinas fosfatases (KIM et al, 1999; K. YAYAMA et al, 2014; A. SAKAI, 1997). Após a montagem dos tecidos no sistema de banho para órgãos isolados, os mesmos passaram pelo período de estabilização e posterior teste de viabilidade. Em seguida, os tecidos agora banhados em meios com pHs (7,4 ou 6,0) foram estimulados com concentrações crescentes de ortovanadato de sódio (10 – 5000µM) (Figura 19). Os tecidos foram, então, submetidos a novas curvas concentração-efeito, porém os tecidos anteriormente banhados em meio com pH 7,4 passaram a ser banhados em meio com pH 6,0, e vice-versa.

Figura 19 – Estímulos contráteis induzidos por adições de concentrações crescentes de ortovanadato de sódio em tecidos de fundo de estômago banhados em meios com diferentes

pHs (7,4 e 6,0).

Fonte: Elaborado pelo autor.

4.5.10 Protocolo para avaliar a sensibilidade das proteínas contráteis de tecidos de fundo de estômago em meios com diferentes pHs (7,4 ou 6,0).

Para avaliar a sensibilidade das proteínas contráteis de tiras de tecidos de fundo de estômago foi realizado um protocolo adaptado de Yanagisawa e Okada (1994), o qual, também foi utilizado por Lima et al. (2014).

Para isso, em primeiro lugar, após a montagem dos tecidos no sistema de banho para órgãos isolados, os mesmos passaram pelo período de estabilização com o posterior teste de viabilidade tecidual. Em seguida, os tecidos, agora em nova solução, foram estimulados com uma alta concentração de KCl (90mM) para se obter um platô de contração. Só então, as soluções das câmaras foram subitamente trocadas por uma nova com mesma composição, para com isso obter um decaimento de resposta controle. Logo após, a solução foi novamente trocada e o mesmo procedimento foi seguido até uma nova obtenção de platô contrátil, também decorrente de estimulação com KCl 90mM. Após a obtenção de um novo platô, ocorreu uma nova troca de solução. Porém, desta vez, as soluções com pHs ajustados em (7,4 ou 6,0) não continham Ca2+ e contavam com uma alta concentração de KCl (90mM). Foram comparados os tempos onde a resposta contrátil correspondia a 50% da resposta máxima obtida com KCl 90mM entre o primeiro e segundo procedimento (Figura 20).

Figura 20 – Protocolo para avaliação da sensibilidade das proteínas contráteis ao cálcio em tiras de fundo de estômago em meios com pHs 7,4 ou 6,0.

Fonte: Elaborado pelo autor.

4.5.11 Protocolo com estimulação por campo elétrico em tecidos de fundo de estômago de ratos, em meio com pHs (7,4 ou 6,0).

Primeiramente foram realizados experimentos teste para a determinação de quais seriam os melhores parâmetros fixos (tempo de cada pulso, voltagem, tempo de estimulo), assim como as frequências a serem utilizadas. Após os testes, os parâmetros fixos definidos foram:

Tempo de cada pulso, 500µs; voltagem, 30v; tempo de estimulação, 10s, e curva frequência resposta, Hz (1 – 30).

Então, com os parâmetros definidos, os tecidos de fundo de estômago foram montados no sistema de banho para órgãos isolados acoplado a um eletroestimulador (modelo LE 12406, panlab, Espanha), com posterior teste de viabilidade dos tecidos e obtenção de resposta contrátil controle por estimulação com KCl 60mM. Seguiu-se da mudança na solução do banho, tendo o pH da solução de ambos os grupos ajustados em 7,4 com posterior realização de uma curva frequência resposta (1 – 30Hz). Em seguida, agora com os tecidos banhados em solução com pH 7,4 ou pH 6,0, foi realizado novamente uma curva frequência resposta (Figura 21). Como pode ser observado, um dos grupos foi estimulado consecutivamente por curvas frequência resposta em meio com mesmo pH (7,4), para com

isso verificar se o tecido diminuiu ou aumentou suas respostas quando submetidos à estímulos sucessivos, assim se caracterizando como um controle.

Figura 21 – Protocolo de estimulação por campo elétrico em tecidos de tiras de fundo de estômago em meios com pHs (7,4 ou 6,0).

Fonte – Elaborado pelo autor.

4.6 Análise Estatística

Todos os resultados estão apresentados como a Média ± Erro Padrão da Média (EPM). Os dados foram analisados pelo teste de Análise de Variância (ANOVA) seguido do teste de Bonferroni. Os resultados foram considerados significativos para o P <0,05.

5 RESULTADOS

5.1 Responsividade de tecidos gastrintestinais isolados de ratos, submetidos a estímulos contráteis

5.1.1. Efeito da variação do pH extracelular na responsividade ao CCh ou KCl (7,4, 7,1, 6,8)

Para verificar o comportamento contrátil de tiras de fundo de estômago e de segmentos de duodeno em meio com diferentes valores de pH, foram construídas curvas concentração-efeito com agentes que promovem estímulos contráteis mediante acoplamento farmacomecânico (CCh) ou acoplamento eletromecânico (KCl).

Para avaliar os efeitos da mudança no pH da solução extracelular em suas respostas contráteis, foram construídas curvas concentração-efeito ao CCh (0,01 a 100 µM) ou KCl (10 a 120 mM). Em ambos os tecidos, fundo de estômago e duodeno, foram construídas quatro curvas com concentrações cumulativas de CCh, sendo que a primeira foi construída em meio com pH 7,4, a segunda com pH 7,1, a terceira com pH 6,8 e a quarta e última com o tecido novamente mantido em solução com pH 7,4. Esta denominada nos gráficos de curva de “recuperação”. As figuras 22 (painel A) e 24 (painel A) representam os experimentos em tiras de fundo de estômago, enquanto a 23 (painel A) e 25 (painel A) representam segmentos de duodeno. Nelas estão indicados em traçados originais os momentos de adição das substâncias teste.

As respostas máximas contráteis obtidas com CCh nas tiras de fundo de estômago (n = 10), como nos segmentos de duodeno (n = 10), foram significativamente maiores (P < 0,05, two way ANOVA, seguido de teste de Bonferroni) na primeira curva construída em meio com pH 7,4 (204,2±12,5% e 54,3±5,7%, respectivamente; valores expressos como % da contração de referência induzida por 60 mM K+) do que nas demais curvas construídas em diferentes valores de pH, quais sejam 7,1 (163,4±15,5% e 27,7±5,6%), 6,8 (154,3±11,2% e 20,3±6,3%). A curva de recuperação (REC - retorno da preparação para meio com pH 7,4) revelou valores significativamente menores que a curva controle (155,5±18,7% e 14,6±8,9%; respectivamente (P < 0,05, two way ANOVA, seguido de teste de Bonferroni) (Figuras 22 e 23, Painel B).

Figura 22 – Curva concentração-efeito para CCh em tecidos de fundo de estômago de ratos.

Painel A – Traçado original de uma curva concentração-efeito ao CCh em tecidos de fundo de estômago em meios com pH 7,4.

Painel B – Gráfico com valores médios das respostas à concentrações crescentes de CCh (0,01 – 100 µM) em tiras de fundo de estomago em preparações mantidas em meio com diferentes valores de pH. As curvas foram construídas em ordem decrescente de pH. Dados expressos em percentual da contração em resposta ao KCl 60 mM em meio com pH fisiológico. *, P < 0,05, representando diferença entre o grupo pH 7,4 (two way ANOVA

seguido de teste de Bonferroni), em relação aos grupos pH 7,1, n = 10, pH 6,8, n = 10 e Rec, n = 10. = Tecido mantido em solução com pH 7,4, = tecido mantido em solução com pH 7,1, = tecido mantido em solução com pH 6,8, = curva construída em solução com pH 7,4 ao final do experimento.

Figura 23 – Curvas concentração-efeito ao CCh em segmentos de duodeno de ratos.

Painel A – Traçado original de uma curva concentração-efeito ao CCh em segmentos de duodeno de ratos. Painel B – Gráfico com valores médios das respostas à concentrações cumulativas de CCh (0,01 – 100 µM) em segmentos de duodeno mantidos em meio com diferentes valores de pH. As curvas foram construídas em ordem decrescente de pH. Dados expressos em percentual da contração em resposta ao KCl 60 mM em meio com pH fisiológico. *, P < 0,01, representando diferença entre o grupo pH 7,4, n = 9 (two way ANOVA seguido de teste

de Bonferroni), em relação aos grupos pH 7,1, n = 9, pH 6,8, n = 9 e Rec, n = 7. = Tecido mantido em solução com pH 7,4, = tecido mantido em solução com pH 7,1, = tecido mantido em solução com pH 6,8, = curva construída em solução com pH 7,4 ao final do experimento.

Já para as respostas contráteis estimuladas por concentrações crescentes de KCl (10 mM a 120 mM) não foram observadas diferenças significativas (P > 0,05) quando as curvas em meios com diferentes valores de pH foram comparadas entre si, tanto em fundo de estômago (n = 12), como em segmentos de duodeno (n = 12) (Figuras 24 e 25, painel B).

Figura 24 – Curvas concentração-efeito ao KCl em tecidos de fundo de estômago de ratos.

Painel A – Traçado original de uma curva concentração-efeito ao KCl em tecidos de fundo de estômago de ratos. Painel B – Gráfico com valores médios das respostas à concentrações crescentes de KCl (10 – 100 mM) em tiras de fundo de estômago em preparações mantidas em meio com diferentes valores de pH. As curvas foram construídas em ordem decrescente de pH. Dados expressos em percentual da contração em resposta ao KCl 60 mM em meio com pH fisiológico. = tecido mantido em solução com pH 7,4, n = 14, = tecido mantido em solução com pH 7,1, n = 14, = tecido mantido em solução com pH 6,8, n = 14, = curva construída em solução com pH 7,4 após as outras curvas, n = 12.

Figura 25 – Curvas concentração-efeito ao KCl em segmentos de duodeno.

Painel A – Traçado original de uma curva concentração-efeito ao KCl em segmento de duodeno de ratos. Painel B – Gráfico com valores médios das respostas à concentrações crescentes de KCl (10 – 100 mM) em segmentos de duodeno mantidos em meio com diferentes valores de pH. As curvas foram construídas em ordem decrescente de pH. Dados expressos em percentual da contração em resposta ao KCl 60 mM em meio com pH fisiológico. = Tecido mantido em solução com pH 7,4, n = 10, = tecido mantido em solução com pH 7,1, n = 10, = tecido mantido em solução com pH 6,8, n = 10, = curva construída em solução com pH 7,4 após as outras curvas, n = 12.

5.1.2 Efeitos de sucessivos estímulos contráteis (curvas concentração-efeito ao CCh) em tiras de fundo de estômago e duodeno, em meio com diferentes valores de pH (6,8, 7,1, 7,4)

Para verificar se as diferenças de efeitos encontrados nas curvas de CCh foram realmente decorrentes das alterações do pH do meio ou do tempo no qual os tecidos ficavam na preparação, foram construídas novas curvas concentração-efeito ao CCh. Porém, desta vez a ordem das curvas foi invertida, ou seja, a primeira curva nesse novo protocolo iniciou-se com os tecidos mantidos em meio com pH 6,8, em seguida com pH 7,1 e por fim com pH 7,4. Esse protocolo foi realizado para ambos os tecidos, tiras de fundo de estômago e segmentos de duodeno.

As variações das respostas contráteis nessa nova ordem foram semelhantes às da ordem anterior. Assim, as respostas obtidas na primeira curva concentração-efeito com pH 6,8 (n = 8) foi significativamente maior (P < 0,05), mas apenas nas concentrações de 0,1, 0,3 e 1 µM de CCh (46,0±6,2%; 98,3±8,1%; 154,9±8%). A comparação foi feita em relação às repostas obtidas nas demais curvas, pH 7,1 (n = 8) (11,2±3%; 41,5±6,3%; 98,3±11,2%) e pH 7,4 (n = 8) (17±9,4%; 45,2±14,9%; 87,4±15,8%) (Figura 26). Já para os segmentos de duodeno, a resposta contrátil em solução com pH 6,8, primeira curva construída, foi significativamente maior (P < 0,05) nas concentrações a partir de 0,3 µM de CCh, com respostas máximas de (40,9 ±7,5%), (21,9±5%), e (14,8±3,9%) para pH 6,8 (n = 8), 7,1 (n = 8) e 7,4 (n = 8), respectivamente (Figura 27). Não foram encontradas diferenças significativas (P > 0,05) entre a primeira curva construída no protocolo anterior, onde a primeira curva foi construída em meio com pH 7,4, e a primeira curva construída em meio com pH 6,8 (Figuras 26 e 27).

Figura 26 – Curvas concentração-efeito ao CCh em diferentes valores de pH (em ordem crescente) em tecidos de fundo de estômago de ratos.

0.01 0.1 1 10 100 0 100 200 pH 6,8 pH 7,1 pH 7,4 pH 7.4 decre

*

*

*

Gráfico com valores médios das respostas à concentrações crescentes de CCh (0,01 – 100 µM) em tiras de fundo de estomago em preparações mantidas em meio com diferentes valores de pH. As curvas foram construídas em ordem crescente de pH. Dados expressos em percentual da contração em resposta ao KCl 60 mM em meio com pH fisiológico. *, P < 0,01, representando diferença entre o grupo pH 6,8, n = 8, (two way ANOVA seguido de

teste de Bonferroni), em relação aos grupos pH 7,1, n = 8, pH 7,4, n = 8. = Tecido mantido em solução com pH 7,4, = tecido mantido em solução com pH 7,1, = tecido mantido em solução com pH 6,8, = primeira curva com pH 7,4 construída no protocolo com pHs decrescentes, n = 10.

Figura 27 – Curvas concentração-efeito ao CCh em diferentes pHs (em ordem crescente) em segmentos de duodeno de ratos.

0.01 0.1 1 10 100 0 50 100 150 pH 6,8 pH 7,1 pH 7,4 pH 7,4 decre

*

Gráfico com valores médios das respostas à concentrações crescentes de CCh (0,01 – 100 µM) em segmentos de duodeno em preparações mantidas em meio com diferentes valores de pH. As curvas foram construídas em ordem crescente de pH. Dados expressos em percentual da contração em resposta ao KCl 60 mM em meio com pH fisiológico. *, P < 0,05, representando diferença entre o grupo pH 6,8, n = 8 (two way ANOVA seguido de

com pH 6,8, = tecido mantido em solução com pH 7,1, = tecido mantido em solução com pH 7,4, = primeira curva em solução com pH 7,4 construída no protocolo com pHs decrescentes, n = 10 .

5.1.3 Efeitos de sucessivos estímulos contráteis (curvas concentração-efeito ao CCh) em meio com pH fisiológico.

Diante dos resultados apresentados anteriormente ficou aparente que a ordem de realização das curvas estava sendo mais determinante na resposta contrátil dos tecidos estimulados com CCh do que as modificações de pH da solução do banho. Assim, com o intuito de confirmar se a realização de curvas repetidas tende a diminuir a resposta, realizamos um novo protocolo. Assim, as preparações de tecidos isolados foram submetidas a três curvas consecutivas de CCh em um mesmo pH (7,4) (Figura 28). É importante salientar, que em virtude das alterações terem ocorrido da mesma forma em ambos os tecidos, nesses novos experimentos utilizamos apenas tiras de fundo de estômago.