Protrusão viral

Os resultados mais interessantes deste trabalho estão relacionados à SP2. Além desta proteína ocorrer em todos os artivírus, o alinhamento da sequência de aminoácidos revelou uma grande conservação, principalmente na segunda metade e

região C-terminal (Figura 9B). Os últimos onze aminoácidos da SP2 (destacados em um retângulo preto na Figura 9B) compartilham alta identidade (variando de 58,33 a 91,67%) e sugerem a composição de um possível sítio de clivagem no qual um mecanismo proteolítico desconhecido ocorre para liberar a SP2 do polipeptídeo da ORF1.

Predições de modelos em 3D e estrutura secundária da SP2 dos diferentes vírus do grupo revelaram uma forma proteica (Figura 13) e padrões de estruturas secundárias (Figura 14) muito similares, indicando uma função conservada para essa proteína em todas as espécies de artivírus. A avaliação dos modelos proteicos apresentou excelentes escores de confiança (Tabela 4).

Figura 13: Modelos estruturais da SP2 de artivírus. Os modelos foram calculados usando o software I-TASSER. Em todos os casos, a estrutura terciária é rica em regiões de α-hélices e lembram um formato de fibra.

Figura 14: Predição de estruturas secundárias para a SP2. Os gráficos indicam regiões folded (verde) e unfolded (vermelho) e regiões de coiled coils, preditas usando os programas Foldindex e COILS, respectivamente. O eixo X representa as posições de aminoácidos e o eixo Y representa os escores de probabilidade.

Tabela 4: Parâmetros e escores dos modelos gerados para a SP2 dos artivírus. Os modelos foram avaliados usando MOLPROBITY e SWISS-MODEL.

Parâmetros e escores IMNV TianV ORV AsV DmV

Clashscore 0,93 5,12 1,11 5,53 5,91

Rotâmeros de cadeias laterais

desfavoráveis 7,84% 9,49% 8,24% 12,15% 9,09%

Ramachandran desfavorável 7,38% 6,09% 5,02% 10,49% 7,58% Ramachandran favorável 80% 87,10% 81,36% 78,28% 78,70%

Carbono Δ 4,44% 7,97% 7,97% 6,82% 8,12%

Ligações de comprimentos ruins 0% 0,09% 0,13% 0% 0,04% Ligações de ângulos ruins 1,35% 1,51% 1,73% 1,73% 1,72%

Escore MolProbity 2,20 2,63 2,23 2,88 2,80 Z-Score -6,28 -6,45 -6,74 -5,65 -5,59 QMEAN score6 0,219 0,174 0,147 0,248 0,252 C-score -1,74 -3,11 -2,85 -3,09 -3,24 TM-score esperado 0,50 ± 0,15 0,36 ± 0,12 0,39 ± 0,13 0,37 ± 0,12 0,35 ± 0,12 RMSD esperado 10,4 ± 4,6 13,5 ± 4,0 12,8 ± 4,2 13,3 ± 4,1 13,8 ± 3,9 Número de decoys 2394 1500 1500 1306 1424 Densidade de cluster 0,2474 0,0651 0,0858 0,0683 0,0572

Em todos os artivírus, a SP2 apresentou uma estrutura “unfolded” ou dinâmica lembrando uma estrutura em fibra, com alto conteúdo de α-hélices e uma região C-terminal estruturada e conservada (Figuras 13 e 14). A região estruturada pode atuar como um “pé”, ancorando as protrusões virais à MCP e formando o complexo de poros.

Como descrito por Tang et al. (2008), a superfície externa do capsídeo do IMNV é formada por regiões em forma de pentágono, e cada pentágono tem um pequeno botão central cercado por dois conjuntos de cinco mesas. A densidade e resolução mais baixa das protrusões do IMNV observadas por microscopia eletrônica (Tang et al., 2008) podem ser explicadas pela flexibilidade lateral do complexo proteico e as mesas podem ser formadas por unidades de SP2, interagindo com uma unidade respectiva no pentâmero da MCP.

Protrusões virais arranjadas como proteínas multiméricas as quais restringem a mobilidade de seus componentes individuais são observadas também na proteína σ1 de reovírus e nas fibras de adenovírus. Em ambos, as protrusões são trímeros

(van Raaij et al., 1999; Chappell et al., 2002). As protrusões da superfície geralmente estão ancoradas no topo do capsídeo em eixos simétricos, como observado no IMNV, reovírus e rotavírus (Yeager et al., 1994; Chandran et al., 2001; Zhang et al., 2005; Tang et al., 2008; Settembre et al., 2011; Nibert & Takagi, 2013).

Já foi observado que a região codificante de SP1 e a extremidade N-terminal de SP2 apresentam o maior número de sítios polimórficos no genoma do IMNV, indicando que essas regiões direcionam mecanismos de adaptação e virulência (Dantas et al., 2015). Os modelos em 3D da SP1 do IMNV correspondem perfeitamente ao domínio “head” da protrusão (Figura 15), corroborando com resultados prévios (Dantas et al., 2015) e lembram as estruturas da proteína P5 do bacteriófago PRD1 e o domínio “knob” da proteína P2 de astrovírus (Merckel et al., 2005; Dong et al., 2011).

Figura 15: Modelo estrutural da SP1 do IMNV. (A) Modelo em 3D gerado pelo I-TASSER mostrando a estrutura globular da proteína. (B) Estrutura tridimensional do IMNV (Adaptado de Tang et al., 2008). (C) Sobreposição na mesma escala do modelo em 3D gerado no I-TASSER na estrutura tridimensional do IMNV. Os números no modelo em 3D indicam as posições de mutações não- sinônimas.

Sequência semelhante à Small Protein1 (SP1), previamente identificada no genoma do IMNV (Dantas et al., 2015), não foi observada nos genomas de AsV, DmV, ORV e TianV. A presença da sequência codificante de SP1 apenas no IMNV revela que essa região foi negativamente selecionada neste grupo, desaparecendo ou sendo alterada na maioria das espécies derivadas. Esta evidência indica que SP1 não atua diretamente em processos basais tais como montagem do capsídeo e empacotamento do RNA, essenciais para a manutenção do vírus.

As descobertas do presente trabalho reforçam a hipótese de que as proteínas SP1 e SP2 formam as protrusões do IMNV e indicam a existência de diferentes fibras nos artivírus. Protrusões compostas por uma ou diferentes proteínas são observadas em outros vírus como reovírus, no qual a proteína σ1 apresenta uma morfologia “head” e “tail” (Chappell et al., 2002), o bacteriófago PRD que possui protrusões formadas por subunidades das proteínas P5 e P2 (Merckel et al., 2005), e bunyavírus com protrusões formadas pelas glicoproteínas G1 e G2 (Persson & Pettersson, 1991).

6 CONCLUSÃO

O polipeptídio codificado pela ORF1 no genoma dos totivírus que infectam artrópodes possivelmente é clivado nos motivos 2A-like, liberando pelo menos duas proteínas hipotéticas que são exclusivas deste grupo, a RBP e a SP2. Cada uma dessas proteínas apresenta características de sequência e estrutura semelhantes entre os artivírus, sendo, portanto, marcadores eficientes para a definição de um novo grupo dentro da família Totiviridae. Essas proteínas certamente determinam características estruturais e de montagem do capsídeo que provavelmente estão envolvidas nos processos de adsorção e penetração do vírus na célula. Este trabalho abre uma nova frente para o estudo da família Totiviridae e motivará abordagens in vitro como Criomicroscopia Eletronônica de Transmissão (CryoTEM), análises de mutação e/ou imunomarcação a fim de determinar em detalhes os mecanismos envolvidos no processamento do dsRNA e as funções peculiares das proteínas dos artivírus.

Os resultados deste trabalho foram publicados na revista Virus Research http://dx.doi.org/10.1016/j.virusres.2015.10.020

CAPÍTULO 2:

SEQUENCIAMENTO E ANÁLISE DO GENOMA DO VÍRUS DA MANCHA