Prova da formação da dupla camada lipídica

Foram realizados ensaios de FRET para provar a formação da dupla camada lipídica nos magnetolipossomas sólidos (SMLs). Para estes ensaios foram preparados SMLs de DPPC contendo as diferentes nanopartículas produzidas.

Para estes ensaios, foram utilizados dois lípidos marcados com sondas fluorescentes, o NBD-C6-HPC (atuando o NBD como doador de energia) e o Rh-DOPE

(em que a rodamina atua como aceitador de energia), que têm sido utilizados com sucesso em ensaios de FRET envolvendo estruturas lipídicas [19]. Os SMLs de cada um dos tipos de nanopartículas foram marcados apenas com NBD-C6-HPC e com ambos os

lípidos NBD-C6-HPC (na primeira camada lipídica) e Rh-DOPE (na segunda camada

lipídica) (figura 4.12), possibilitando, deste modo, a comparação dos espetros de fluorescência dos SMLs marcados apenas com o doador, com o dos SMLs marcados com o doador e o aceitador de energia.

Figura 4.12: Espetros de fluorescência (λexc = 470 nm, sem excitação da rodamina) de

SMLs marcados com NBD-C6-HPC e com ambos os lípidos NBD-C6-HPC e Rh-DOPE,

contendo as diferentes nanopartículas preparadas: a) NPs núcleo/coroa de MnFe2O4/Au, b) NPs de Au decoradas com MnFe2O4; c) NPs de MnFe2O4 decoradas com Au.

Todos os SMLs foram excitados a 470 nm, de modo a excitar-se apenas a molécula doadora (NBD). Em primeiro lugar, para os SMLs marcados apenas com

NBD-C6-HPC, verifica-se a típica banda de fluorescência do NBD. Por outro lado, no

caso dos SMLs marcados com NBD-C6-HPC e Rh-DOPE, é possível observar-se uma

forte diminuição da banda de emissão do NBD-C6-HPC e o aparecimento da banda de

emissão da rodamina, próximo dos 583 nm [20], sendo isto resultado da transferência de energia entre as moléculas doadoras excitadas (NBD-C6-HPC) para as moléculas

aceitadoras (Rh-DOPE). Desta forma, é possível confirmar a existência de FRET e, consequentemente, a formação da dupla camada lipídica. O aumento mais evidente na emissão do aceitador de energia é observado para o caso das nanopartículas núcleo/coroa de MnFe2O4/Au, quando comparado com os restantes casos.

Como resultado destes ensaios, foram calculadas as eficiências de FRET e as distâncias doador-aceitante correspondentes, a partir das equações 2.15 a 2.18, sendo que os valores obtidos se encontram na tabela 4.3.

Tabela 4.3: Eficiências de FRET (ФFRET), Raio de Förster (R0) e distâncias doador-

aceitador (r) dos ensaios de formação da dupla camada lipídica em magnetolipossomas sólidos (SMLs). ФFRET R0 (nm) r (nm) SMLs contendo NPs núcleo/coroa de MnFe2O4/Au 0,65 3,36 3,06 SMLs contendo NPs de Au decoradas com NPs de MnFe2O4

0,91 3,17 2,14

SMLs contendo NPs de MnFe2O4

decoradas com NPs de Au 0,83 3,70 2,84

Em termos de eficiência de transferência de energia, esta é mais baixa para os SMLs contendo nanopartículas núcleo/coroa de MnFe2O4/Au e mais elevada para os

SMLs contendo NPs de Au decoradas com NPs de MnFe2O4. No caso das distâncias

doador-aceitador correspondentes, o caso de maior proximidade entre doador e aceitador é o dos SMLs com nanopartículas de ouro decoradas com partículas de ferrite de manganês. Diferentes autores referem, para a membrana celular, espessuras que podem variar entre os 7 e os 9 nm [21] e os 7,5 a 10 nm [22] para o caso de bicamadas moleculares. Assim, pode-se concluir que as moléculas doadoras e aceitadoras utilizadas se encontram, respetivamente, na primeira e na segunda camada lipídica, envolvendo as diferentes nanopartículas sintetizadas. É assim possível confirmar a formação da dupla camada lipídica, mais compacta para os SMLs contendo NPs de Au decoradas com NPs de MnFe2O4, evidenciada pela menor distância entre as moléculas

94 4.4 Ensaios de irradiação dos SMLs

Como já referido, os vários tipos de nanopartículas mistas de MnFe2O4 e Au

foram produzidas, foram cobertas com uma bicamada lipídica de DPPC para o caso das NPs núcleo/coroa de MnFe2O4/Au e NPs de Au decoradas com NPs de MnFe2O4,

enquanto a bicamada das NPs de MnFe2O4 decoradas com NPs de Au foi formada com

DOPE e DPPE. Em todos os magnetolipossomas sólidos foi incorporado o lípido marcado Rh-DOPE, procedendo-se posteriormente à irradiação dos mesmos com uma lâmpada de arco de Xénon de 200 W, usando nesta um filtro de corte que apenas permite a passagem de comprimentos de onda superiores a 600 nm. Nestas condições, registou-se a intensidade de fluorescência em função do tempo.

Ao excitar-se o ouro, é possível ocorrerem vários efeitos distintos, cuja eficiência depende da intensidade da luz incindente:

 Aquecimento local induzido pelo ouro, que se propaga ao longo da estrutura por difusão de calor, e que poderá originar uma inibição de fluorescência da rodamina por aumento da eficiência dos processos não radiativos de desexcitação.

 Aumento do rendimento quântico de fluorescência da rodamina por efeito plasmónico, correspondente ao aumento do campo elétrico na vizinhança das partículas de ouro.

Poderia ainda existir a possibilidade de ocorrer a inibição de fluorescência da rodamina por transferência eletrónica ou de energia a partir da rodamina excitada, caso esteja perto da superfície de ouro (a menos de 10 nm), não implicando este processo a excitação do ouro.

Na figura 4.13 é possível observar-se os diferentes gráficos de intensidade de fluorescência da rodamina em função do tempo para as diferentes nanopartículas produzidas, quando irradiadas com um comprimento de onda superior a 600 nm.

Figura 4.13: Intensidade de fluorescência (normalizada à intensidade inicial) da

rodamina em função do tempo para as diferentes nanopartículas irradiadas a λ> 600 nm: a) nanopartículas núcleo/coroa de MnFe2O4/Au, b) NPs de Au decoradas com NPs de

MnFe2O4, c) NPs de MnFe2O4 decoradas com NPs de Au.

Assim, para as nanopartículas núcleo/coroa de MnFe2O4/Au e as nanopartículas

de MnFe2O4 decoradas com NPs de Au (figura 4.13 a e c), verifica-se a diminuição da

intensidade de fluorescência da rodamina Rh-DOPE com o aumento do tempo de irradiação, sendo esta resultado de um processo de inibição (quenching) de fluorescência, por aumento da temperatura local, que se deve ao efeito do ouro.

Já para o caso das nanopartículas de Au decoradas com NPs de MnFe2O4 (figura

4.13 b), verifica-se que não há praticamente efeito ao longo do tempo, sendo que, neste caso, o ouro estará mais longe da bicamada lipídica exterior onde se encontra incorporada a rodamina (que está ligada a uma cadeia lipídica), não se observando a inibição de fluorescência da sonda.

Para todos os casos representados, verificou-se o aumento da temperatura da solução entre 2 a 3º C durante os ensaios, o que não é suficiente para causar a inibição de fluorescência observada. Os resultados indicam que é necessário um tempo ainda significativo para o calor difundir e atingir os fluoróforos (moléculas de rodamina), dando-se assim a inibição da sua fluorescência. Estes resultados são similares aos

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em que também se verificou uma diminuição da fluorescência ao longo do tempo devido a um aumento local da temperatura [23].

A partir destes resultados, é possível concluir-se que estes sistemas poderão ser promissores para futuras aplicações em terapias fototérmicas [24; 25], nomeadamente na terapêutica do cancro.

Referências do Capítulo 4

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