Provas culturais, bioquímicas e antibiograma

Nos casos em que se obteve um resultado positivo para a oxidase e negativo para a fermentação da glucose procedeu

de cultura King B (Biolab, Refª 1998; Pintado et al., 2010). Em

(Oxoid – Refª CM0405) e Agar Sangue (

Foram ainda selecionadas algumas culturas para identificação por meio da galerias API 20NE (bioMérie

3.3.1. Fluorescência no meio King B

No meio King B podemos observar a produção de pigmentos fluorescentes pelas culturas bacterianas. Cada cultura foi assim inoculada no meio de

durante 24 h a 48 h. Após este período, as placas foram observadas com luz ultravioleta no aparelho SVL, Labnorma 220V

tendo resultados positivos para cores entre roxo e castanho se não existir alteração de cor ou se se observar uma cor amarela A prova de fermentação da glucose permite distinguir entre microrganismos que

não fermentam a glucose, observando-se, nos casos em que a prova é alteração da cor do meio de roxo para amarelo (Figura 2). Esta prova foi realizada inoculando por picada central um tubo com o meio de cultura segundo

Milk and milk products – Method for the enumeration of Pseudomonas tubo foi depois incubado a 25°C durante 24 h, sendo depois realizada a sua

Prova da fermentação da glucose positiva (à esquerda) e negativa (à direita).

Provas culturais, bioquímicas e antibiograma

casos em que se obteve um resultado positivo para a oxidase e negativo para a procedeu-se à crioconservação das culturas e à inoculação dos meios Biolab, Refª KAB20500) e Agar Queijo com e sem tirosina (

). Em alguns casos inoculou-se ainda os meios Mueller Hinton a ) e Agar Sangue (bioMérieux, Marcy l´Étoile, França, Refª Foram ainda selecionadas algumas culturas para identificação por meio da

bioMérieux, Marcy l´Étoile, França, Refª 20050).

Fluorescência no meio King B

No meio King B podemos observar a produção de pigmentos fluorescentes pelas culturas bacterianas. Cada cultura foi assim inoculada no meio de cultura King B e incub

. Após este período, as placas foram observadas com luz ultravioleta no abnorma 220V, 50 Hz (Figura 3).

sitivos para cores entre roxo e castanho escuro observar uma cor amarela. permite distinguir entre microrganismos que

se, nos casos em que a prova é ). Esta prova foi realizada segundo a Norma ISO Method for the enumeration of Pseudomonas spp.. O

h, sendo depois realizada a sua leitura.

Prova da fermentação da glucose positiva (à esquerda) e negativa (à direita).

e antibiograma

casos em que se obteve um resultado positivo para a oxidase e negativo para a se à crioconservação das culturas e à inoculação dos meios ) e Agar Queijo com e sem tirosina (Carreira et al., ainda os meios Mueller Hinton agar França, Refª 43041). Foram ainda selecionadas algumas culturas para identificação por meio da inoculação de

No meio King B podemos observar a produção de pigmentos fluorescentes pelas culturas cultura King B e incubada a 22°C . Após este período, as placas foram observadas com luz ultravioleta no

3.3.2. Escurecimento no meio Agar Queijo

De modo a testar a capacidade de cada cultura para produzir pigmentos castanhos e escurecer a superfície dos queijos, cada cultura foi inoculado numa placa de Agar Queijo com tirosina e noutra placa de Agar Queijo sem tirosina. Após a inoculação as placas foram incubadas a 25°C durante pelo menos 48 h. O escurecimento dos dois meios foi registado periodicamente ao longo de dois meses.

3.3.3. Suscetibilidade a antibióticos

No estudo da suscetibilidade aos antibióticos foram testados os seguintes antibióticos: ciprofloxacina, enrofloxacina, penicilina G, sulfametoxazol + trimetoprim, gentamicina, imipenem, ceftazidima, ampicilina, piperacilina + tazobactam, oxitetraciclina, estreptomicina e amoxicilina + ácido clavulânico. Estes doze antibióticos, cujas características se encontram na Tabela 7, foram distribuídos por duas placas de Petri.

Tabela 7 - Especificação dos antibióticos utilizados no estudo de suscetibilidade.

Posição no dispensador

Antibiótico Características Grupo

P la ca P et ri 1

1 Ciprofloxacina CPI, 5 μg, Oxoid - Ref. CT0425B Quinolonas 2 Enrofloxacina ENR, 5 μg, Oxoid - Refª CT06398 Fluorquinolonas 3 Penicilina G P, 10IU, Oxoid - Refª CT0043B β-lactâmico

4 Trimetoprim +

Sulfametoxazol

SXT, 25 μg, Oxoid - Refª CT0052B Diamino-pirimidina + Sulfonamidas

5 Gentamicina CN, 10 μg, Oxoid - Refª CT0024B Aminoglicosídeos 6 Imipenem IPM, 10 μg, Oxoid - Refª CT0455B β-lactâmico -

Carbapenem P la ca P et ri 2

1 Ceftazidima CAZ, 30 μg, Oxoid - Refª CT0412B β-lactâmico – Cefalosporinas de 3ª geração

2 Ampicilina AMP, 10 μg, Oxoid - Refª CT0003B β-lactâmico

3 Piperacilina +

Tazobactam

TZP, 110 μg, Oxoid - Refª CT0725B Penicilina semi- sintética

+ Triazolilmetilsulfona 4 Oxitetraciclina OT, 30 μg, Oxoid - Refª CT0041B Tetraciclina

5 Estreptomicina S 10, μg, Oxoid - Refª CT0047B Aminoglicosídeos

6 Amoxicilina +

Ácido clavulânico

Este teste foi baseado na Norma M100S (2016) da Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Para este teste foi utilizada a cultura de referência Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

A cultura de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 foi preparada a partir de uma lentícula (Ielab – BAControl-5). Esta foi adicionada a 20 ml de água destilada esterilizada e aguardou- se a dissolução da mesma durante 10 min. Após esse período, 0,1 ml da cultura foi inoculada por espalhamento numa placa de Petri com meio TSA. Repetiu-se o procedimento de inoculação no meio TSA mas agora de uma ansada de 1 µl de cultura. As placas foram depois incubadas a 37°C durante 48 h.

Na realização deste estudo foi utilizada cultura jovem, obtida após inoculação em AN e incubação a 30°C durante aproximadamente 18 h. A cultura de referência Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 foi incubada a 37°C durante o mesmo período. Com a cultura jovem foi realizada uma suspensão bacteriana com densidade celular equivalente aos padrões 0,5 e 1 da escala de McFarland (bioMérieux, Marcy l´Étoile, França, Refª 70900), a qual serviu para inocular a superfície de duas placas com meio de cultura Mueller Hinton Agar. Nessa mesma placa, e com a ajuda do dispensador de discos da marca OXOID (Figura 4), foram distribuídos os discos dos antibióticos. A incubação decorreu durante 48 h, com uma primeira observação às 24 h, a uma temperatura de 28°C (durante os primeiros ensaios) e 30°C (restantes ensaios) durante 24 h.

Após o período de incubação, foi feita a medição dos halos de inibição com uma craveira digital (Metrica, resolução de 0,01mm) (Figura 5) e as culturas bacterianas testadas foram classificadas como sensível – S, intermédia – I e resistente – R aos agentes antimicrobianos testados. Esta classificação foi feita comparando os valores obtidos com os indicados na Norma M100S (2016) (Tabela 8).

Figura 4 - Dispensador de discos da marca OXOID. Figura 5 - Medição dos halos em redor dos discos

Tabela 8 – Valores padrão (mm) dos diâmetros das zonas de inibição, usados para a classificação das culturas como Suscetíveis (S), Intermédias (I) ou Resistentes (R).

Antibióticos S I R P la ca d e P et ri 1 1 Ciprofloxina ≥ 21 16-20 ≤ 15 2 Enrofloxacina - - - 3 Penicilina G - - - 4 Trimetoprim/Sulfametoxazol - - - 5 Gentamicina ≥ 15 13-14 ≤ 12 6 Imipenem ≥ 19 16-18 ≤ 15 P la ca d e P et ri 2 1 Ceftazidima ≥ 18 15-17 ≤ 14 2 Ampicilina - - - 3 Piperacilina + Tazobactam ≥ 21 15-20 ≤ 14 4 Oxitetraciclina - - - 5 Estreptomicina - - -

6 Amoxicilina + Ácido clavulânico - - -

Para o controlo de qualidade dos ensaios foi utilizada a cultura de referência Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Os valores padrão dos diâmetros das zonas de inibição esperados para esta cultura estão indicados na Tabela 9.

Tabela 9 – Valores padrão (mm) dos diâmetros das zonas de inibição para o controlo de qualidade usando a cultura Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

Antibióticos Valores padrão (mm)

P la ca d e P et r 1 1 Ciprofloxina 25-33 2 Enrofloxacina - 3 Penicilina G - 4 Trimetoprim + Sulfametoxazol - 5 Gentamicina 17-23 6 Imipenem 20-28 P la ca d e P et ri 2 1 Ceftazidima 22-29 2 Ampicilina - 3 Piperacilina + Tazobactam 25-33 4 Oxitetraciclina - 5 Estreptomicina -

6 Amoxicilina + Ácido clavulânico -

Dado estarmos a trabalhar com alguma diversidade de culturas bacterianas, ao longo do estudo os parâmetros aplicados foram sendo adaptados às diferentes culturas. Foram efetuadas repetições sempre que necessário. Por exemplo, houve necessidade de trabalhar com duas temperaturas de incubação (28°C e 30°C), com duas densidades celulares do

inóculo (UFC/ml) (padrão 0,5 e 1 da escala de McFarland), e com o meio de cultura Mueller Hinton agar (sem e com sangue de cavalo desfibrinado). Os ensaios foram realizados em duplicado em alturas diferentes.

3.3.4. Identificação com base no API 20NE

No período de estágio foram realizadas cerca de quarenta e três identificações ao nível da espécie ou do género, após inoculação de galerias bioquímicas miniaturizadas API 20NE. Estas quarenta e três identificações, juntamente com trinta realizadas em estudos anteriores, perfaz um total de setenta e três culturas identificadas.

As culturas selecionadas para identificação provêm de zaragatoas a equipamentos e manipuladores (n= 26), queijos (n= 5), leite de ovelha (n= 8), leite de cabra (n= 6), leite de vaca (n= 1), água (n= 26) e cinta de pano (n= 1).

A galeria bioquímica API 20NE (bioMérieux, Marcy l´Étoile, França, Refª 20050) permite realizar cerca de 20 testes: 8 testes convencionais (redução de nitrato, produção de indol, fermentação da D-glucose e hidrólise de L-arginina, ureia, esculina, gelatina e 4-nitrofenil-β D-galactopiranosídeo) e 12 testes de assimilação (D-glucose, L-arabinose, D-manose, D- manitol, N-acetil-glucosamina, D-maltose, gluconato de potássio, ácido cáprico, ácido adípico, ácido málico, citrato de trisódio, ácido fenilacetato). O teste da oxidase deve ser realizado previamente e deverá dar um resultado positivo.

Para a inoculação dos API´s foi feita a repicagem de 1 µl das culturas bacterianas selecionadas, entretanto conservadas a -80°C, para o meio de cultura TSYEA ou NA, seguido de um período de incubação de 24 h à temperatura de 30°C. A partir da cultura assim obtida foi preparada uma suspensão bacteriana (0,5 na escala de McFarland).

Os 20 microtubos da galeria API 20NE são compostos por meios de cultura desidratados com substratos específicos que foram inoculados de forma diferente: os 8 microtubos correspondentes aos testes convencionais foram inoculados com a suspensão bacteriana preparada como referido no parágrafo anterior e os restantes 12 testes foram inoculados com a mistura de 200 µl da suspensão bacteriana que sobrou com o conteúdo da ampola API AUX Medium, 7ml (bioMérieux, Marcy l´Étoile, França, Refª 20070). Antes da primeira incubação (24 h ± 2 h a 29°C ± 2°C) as cúpulas dos microtubos correspondentes aos testes GLU, ADH, URE foram selados com óleo de parafina (bioMérieux, Marcy l´Étoile, França, Refª 70100).

Os resultados foram lidos com o auxílio do quadro de leitura incluído no kit API 20 NE, com base na viragem de cor (nos testes convencionais) e na presença de turvação (nos testes de assimilação). Neste último caso, uma cúpula com turvação indica um resultado de assimilação do substrato positivo e uma cúpula transparente indica um resultado negativo.

A obtenção dos resultados para os testes de redução de nitratos (NO3) e produção de indol (TRP) envolve os seguintes passos:

- Teste NO3: é necessário adicionar uma gota de NIT 1 (bioMérieux, Marcy l´Étoile, França, Refª 70442) e NIT 2 (bioMérieux, Marcy l´Étoile, França, Refª 70442) e esperar 5 min. O resultado é positivo se a reação apresentar uma cor vermelha. No caso de um resultado negativo, adicionar pó de zinco e, se após 5 min, o meio continua incolor o resultado para a redução de nitratos é positivo, e se o meio passa de incolor a rosa-vermelho o resultado para a redução de nitratos é negativo.

- Teste TRP: é necessário adicionar uma gota do reagente JAMES (bioMérieux, Marcy l´Étoile, França, Refª 70542), tendo um resultado positivo caso exista uma cor rosa difundida pela cúpula.

Depois da primeira leitura às 24 h, as galerias foram incubadas mais 24 h à mesma temperatura. Após este período, todos os testes (à exceção dos testes de redução de nitratos, de produção de indol e de fermentação da glucose, que têm uma única leitura após 24 h de incubação) foram novamente lidos e registados. Por fim, foi obtido o perfil numérico para cada cultura em processo de identificação, através do qual foi feita a identificação após

consulta da base de dados da bioMérieux, disponível online em

https://apiweb.biomerieux.com.

3.4. Caracterização molecular

A caracterização molecular das duzentas e cinquenta e duas culturas foi realizada no laboratório Tec Labs – Centro de inovação, da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa.

Foi usada a técnica de Random amplified polymorphic DNA (RAPD), uma técnica de PCR fingerprinting, usando os primers csM13 e PH.

3.4.1. Extração de DNA

Após crescimento em meio de cultura AN a 30°C retirou-se uma ansada de 10 µl de cultura e adicionou-se a 250 µl de TE com lisozima (10 mg/ml). Incubou-se entre 30 a 60 min a 37°C num bloco de aquecimento (Grant – UBD2 - Nº serie G6 04 19001). De seguida adicionou-se 500 µl de reagente GES (5 M tiocianato de guanidina; 10 mM EDTA pH 8; 0,5% sarcosil), agitou-se por inversão e colocou-se no gelo durante cerca de 5 a 10 min (a lise é confirmada quando a solução fica transparente). Ao tubo anterior foi depois adicionado 250 µl de 7,5 M NH4Ac frio, agitou-se e colocou-se no gelo durante 10 min, após o que se adicionou 1 ml da mistura 24:1 de clorofórmio (CHCl3 – Group Carlo Erba Reagents, Refª 438603) /álcool isoamílico (C5H12O – Merck, Refª 979) e se misturou o conteúdo do tubo por inversão (apesar do clorofórmio não ser miscível com a água a agitação devia permitir que o mesmo atue sobre os lípidos e proteínas, permitindo a extração). A partir deste passo os tubos não são agitados no Vortex.

Os tubos foram depois centrifugados (Beckman Coulter, Microfuge 18 Centrifuge) a 14000 rpm durante 10 min e recuperados os sobrenadantes para novos tubos (Eppendorf de 2 ml), com cuidado para não arrastar a interfase. Adicionou-se depois volume igual de isopropanol frio e misturou-se suavemente por inversão, podendo nesta fase observar-se a formação de um novelo. Seguiu-se uma centrifugação (14000 rpm, 10 min) e eliminou-se o sobrenadante. Antes de centrifugar de novo (14000 rpm, 10 min) e descartar o sobrenadante, foi adicionado 1ml de etanol a 70% [200 ml = 140 ml de etanol absoluto (CH3CH2OH – Panreac, Barcelona, Espanha, Refª 121086.1212) + 60 ml H2O], o qual ficou a evaporar colocando o Eppendorf aberto sobre a bancada. Depois do etanol evaporar, dissolveu-se o conteúdo em 50 µl de TE (10 mM Tris e 1 mM EDTA).

Após obtenção da amostra de DNA, observou-se uma alíquota de 5 µl em gel de agarose, para avaliar a quantidade do DNA em termos de dimensão média dos fragmentos obtidos. A eletroforese para a quantificação foi realizada nas seguintes condições: gel com agarose (Invitrogen, Paisley, Reino Unido, Refª 15510-027) 1,2% em TBE 0,5X (realizado a partir de TBE 5X – Invitrogen, Paisley, Reino Unido, Refª LC6678), em tina com TBE 0,5X, estando ligada a uma fonte de energia a 90 V durante 1 h, tendo uma proporção de gel loading (10X - Invitrogen, Paisley, Reino Unido) de 1 µl por 5 µl de amostra de DNA. Após observação dos fragmentos de DNA no gel, e quando se julgou necessário, foi realizada uma diluição do DNA com TE (na ordem 1:100 ou 1:1000).

3.4.2. Reação PCR e eletroforese

A caracterização genotípica foi realizada por PCR-fingerprinting utilizando-se os primers csM13 (5`-GAGGGTGGCGGTTCT-3`) e PH (5`-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3`). O primer csM13 está incluído no grupo dos primers direcionados para regiões flanqueadas ou contendo micro/mini satélites e o PH é um primer universal que geralmente é utilizado como a sequência inversa para a amplificação do gene 16S rDNA (Chambel et al., 2007).

O PCR fingerprinting foi realizado usando as seguintes quantidades de reagentes por 1x reação: 18,8 µl de água ultra pura (Gibco, Refª 10977-035), 2,5 µl de solução tampão (PCR Buffer Rxn, 10X, MgCl2 1,25 ml – Invitrogen, Paisley, Reino Unido, Refª y02028), 1,5 µl de MgCl2 (50 mM MgCl2 – Invitrogen, Paisley, Reino Unido, Refª y02016), 0,5 µl de dNTPs, 0,5µl primer, 0,2 µl Taq DNA Polimerase (5 U/µl – Invitrogen, Paisley, Reino Unido, Refª 18038- 026) e 1 µl de DNA, perfazendo assim um total de 25 µl de solução por amostra. Em cada Mix foi realizado um controlo (no qual é substituído o DNA por água ultra pura) e 10% de réplicas.

A amplificação foi realizada no termociclador (Biometra – T Gradient e Biometra – T1 Thermocycler) nas seguintes condições: 1 ciclo (95°C por 5 min), 41 ciclos (95°C por 1 min, 50°C por 2 min, 72°C por 2 min) e 1 ciclo (72°C por 5 min) para o primer csM13 e 1 ciclo (94°C por 3 min), 35 ciclos (94°C por 1 min, 35°C por 2 min, 72°C por 1 min) e 1 ciclo (72°C por 5 min) para o primer PH.

Após a amplificação da amostra, foi feita a corrida das amostras em gel de agarose a 1,2% preparada em TBE 0,5X, sendo a corrida realizada durante 3 h a 90 V com um total de 10 µl de amostra com 2 µl de gel loading e o marcador 1 kb Plus DNA Ladder (100 pb a 12000 pb) (Invitrogen, Paisley, Reino Unido, Refª 10787018). Os géis são depois corados em brometo de etídio, cerca de 10 min, e observados em luz ultravioleta através do aparelho de aquisição de imagem ligado ao programa Alliance 4.7. (Alfagene, Uvitec Cambridge). As imagens são guardadas em formato TIFF para serem analisadas no programa BioNumerics (versão 6.6; Applied Maths, Bélgica) e posterior obtenção dos dendrogramas com base no coeficiente de correlação de Pearson para avaliação das relações de semelhança.

Para análise dos resultados e cálculo da reprodutibilidade (valor médio dos valores de similaridade entre pares de duplicados) foram realizados duplicados para cada primer, sendo depois analisada a similaridade entre cada par no dendrograma com base no coeficiente de correlação de Pearson. Ou seja, o valor de reprodutibilidade é representado pelo valor médio dos valores de similaridade entre pares de duplicados.

3.5. Crioconservação a -80ºC

Após o isolamento e caracterização prévia das 65 culturas bacterianas obtidas no período de estágio, estas foram crioconservadas utilizando Skim Milk (VWR, Refª 84615.0500) com glicerol (VWR, Refª 24387.292).

A conservação foi realizada a partir de cultura jovem (menos de 24 h de crescimento) repicada em meio LB Agar [Triptona (10 g/L), NaCl (10 g/L), Extrato de levedura (YE) (5 g/L) e Agar (15 g/L)]. Em cada criotubo foi adicionado 1 ml de Skim Milk com glicerol, o qual foi depois inoculado com uma ou duas ansadas de 1 µl de cultura. Cada tubo foi identificado, numerado e armazenado em caixas a -80°C, sendo a conservação realizada para cada cultura em duplicado.

No momento da conservação foi realizado o teste de esterilidade do Skim Milk, por espalhamento de 1 ml em placa de LB Agar e incubadas a 25°C durante 24 h.

Todas as restantes culturas usadas neste estudo se encontravam crioconservadas a -80°C pelo método descrito anteriormente.