PURIFICAÇÃO DE COL

O COL bruto foi purificado pela cromatografia líquida de troca iônica.

1.5.1 Primeiro estágio

Vários procedimentos foram realizados para a padronização de um método para purificação do COL bruto.

1.5.1.1 Caracterização do COL bruto

Amostras de COL bruto foram diluídas em água destilada nas razões: 1:2, 1:10, 1:50 e

1:100. A proteína foi submetida à leitura da absorbância no comprimento de onda de 260 a 280 nm e caracterizada pelo método do gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE). Diferentes composições de solução tampão (tampão de amostra) específicas para uso nas amostras a serem caracterizadas por este método foram testadas:

- tampão de amostra 2X concentrado sem redução;

- tampão de amostra 2X concentrado com redução, contendo mercaptoetanol.

1.5.1.2 Seleção da matriz para a coluna de cromatografia

A resina DEAE-sepharose (dietilaminoetil-sepharose) CL-6B (DEAE) foi selecionada para preenchimento da coluna de cromatografia, de acordo com trabalhos de purificação encontrados na literatura. O volume da coluna foi determinado pelo emprego da fórmula de cálculo do volume de um cilindro:

V = R2h (eq. III.1) onde,

V = volume,

R2 _{= raio interno da coluna ao quadrado,} h = altura da coluna.

1.5.1.3 Determinação do pH

O pH adequado a ser usado na cromatografia de troca iônica foi determinado, experimentando quatro diferentes pH: 6,8; 7,4; 8,2; e 10,0. A solução tampão (ST) foi preparada com Tris-HCl 40 mM e foram adicionados H2NCONH2 e NaCl para atingir concentração aproximada de 2 M e 50 mM respectivamente. O pH de quatro diferentes ST foi controlado gotejando solução de HCl 1 M, sob agitação magnética. Para o controle do pH da DEAE, quatro volumes desta resina, 25 mL cada,

dessa resina foram totalmente imersos em ST com os diferentes pH, durante a noite a 4°C. Amostras de COL bruto foram dialisadas contra ST com os pH já citados durante 24 h, com três trocas da solução. Assim, quatro volumes de resina DEAE e quatro amostras de COL bruto foram obtidas e equilibradas nos diferentes pH: 6,8, 7,4, 8,2 e 10,0.

1.5.1.4 Procedimentos de purificação

A resina DEAE pH 6,8 foi centrifugada a 1000xg durante 15 min a 4°C e foi lavada e filtrada por quatro vezes com 100 mL de ST a cada lavagem, no filtro do funil de vidro sinterizado, sob vácuo leve. Em um tubo Falcon, 5 mL da amostra de COL bruto pH 6,8 foram misturados com 20 mL de resina DEAE pH 6,8, no agitador rotatório por 40 min. A mistura foi centrifugada 500xg por 30 min a 4°C. O sobrenadante foi coletado e reservado à mesma temperatura. Prosseguiu-se com lavagens da DEAE com 100 mL de ST pH 6,8 por quatro vezes, e depois com uma lavagem da DEAE com 30 mL de ST pH 6,8 acrescida de NaCl 1 M, no filtro do funil de vidro sinterizado. Todas as lavagens foram coletadas separadamente e armazenadas a 4°C e submetidas a leituras da absorbância no comprimento de onda de 226 nm, no espectrofotômetro. Posteriormente essas amostras foram caracterizadas por SDS-PAGE.

Os mesmos procedimentos foram aplicados aos materiais com os pH 7,4; 8,2; e 10,0.

1.5.1.5 Definição da concentração da solução eluente

A DEAE foi equilibrada no pH 10,0, e 10 mL desta resina foi centrifugada a 1000xg por 15 min a 4°C, com 5 mL de COL bruto pH 10,0. A resina com COL foi colocada no funil de Büchner forrado com filtro de papel e foi lavado sucessivamente com soluções de concentrações diferentes de NaCl: 0,10 M, 0,15 M, 0,25 M, 0,50 M, 0,75 M e 1,0 M. As soluções foram coletadas separadamente e submetidas a leitura no espectrofotômetro, no comprimento de onda de 226 nm e caracterizadas por SDS-PAGE.

1.5.2 Segundo estágio

De acordo com os resultados dos experimentos determinados no primeiro estágio, foi realizada a purificação do COL bruto no sistema de cromatografia líquida de baixa pressão.

1.5.2.1 Preparação da solução tampão (ST) e da solução eluente (SE)

HCl concentrado foi usado para obter-se o pH 10,0 de 2 L de uma solução de Tris 40 mM. A esta solução acrescentou-se NaCl 50 mM (58,50 g) e uréia 2 M (249,85 g), sob agitação magnética, até a mistura apresentar-se transparente. A força iônica desta solução, em torno de 4,75 mS/cm, foi medida no condutivímetro usando-se a solução de cloreto de potássio (KCl) 0,01 M, que apresenta a

condutividade de 1.413 S/cm como padrão à temperatura de 26°C. A ST foi mantida a 4°C. A solução para realizar a eluição da proteína adsorvida na resina foi preparada com 2 L de ST pH 10,0 acrescida de NaCl 0,25 M (29,25 g).

1.5.2.2 “Empacotamento” da coluna para cromatografia de troca iônica

O volume de 50 mL de DEAE foi preparado com sua total imersão em ST pH 10,0 durante a noite a 4°C. A coluna foi preenchida, aos poucos, com DEAE, usando-se 400 mL de ST pH 10,0 através da tubulação do sistema de cromatografia, até sua total compactação. Após o “empacotamento”, a coluna foi mantida a 4°C.

1.5.2.3 Procedimentos de purificação

A coluna foi mantida à temperatura ambiente e, depois, com o fluxo de 2 mL/min no sistema de cromatografia, foi equilibrada com 500 mL de ST pH 10,0. A parte superior da coluna foi aberta e 3 mL da amostra de COL bruto pH 10,0 foram misturados, vagarosamente, com a resina, usando uma espátula de plástico. DEAE + COL bruto foi homogeneizada em um agitador giratório, com velocidade 20, por 40 min. De volta ao sistema de cromatografia a resina foi lavada com 400 mL de ST, usando o mesmo fluxo anterior. O COL adsorvido na DEAE foi eluído com 200 mL de SE, com fluxo de 2 mL/min. Após eluição da amostra a resina foi lavada com 100 mL de solução de NaCl 2 M, seguida da lavagem com 400 mL de solução de álcool ISO-propílico 30% e com 200 mL de água destilada, usando fluxo de 5 mL/min para cada uma das soluções.

As amostras foram coletadas separadamente, submetidas à leitura no espectrofotômetro a 226 nm, e mantidas a 4°C para serem caracterizadas por SDS-PAGE.

1.5.2.4 Diálise e concentração das amostras

Após a identificação das frações coletadas que continham o COL, as amostras foram dialisadas contra solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,001 M, em sacos para diálise de membranas de celulose, por 16 h, à temperatura de 4°C, sob agitação magnética lenta. A solução de diálise foi renovada neste intervalo de tempo por três vezes.

As amostras dialisadas foram congeladas em nitrogênio líquido e mantidas à temperatura de –_80°C em freezer biológico até o momento de serem concentradas no aparelho liofilizador, onde permaneceram por 36 h.