Purificação de bacteriocinas e lipopeptídeos

Diversos passos e diferentes métodos foram executados para purificação de bacteriocinas e lipopeptídeos. Em cada um deles foi quantificada a atividade antimicrobiana através da titulação do extrato bruto (UA/mL) (conforme item 4.4.4.2). A seguir serão apresentados os métodos de purificação que foram utilizados com sucesso para o isolamento de bacteriocinas e lipoeptídeos.

4.3.10.1 Crescimento da cultura e obtenção do sobrenadante

O micro-organismo produtor foi crescido frascos Erlenmeyer contendo 200 mL de caldo BHI, pH 7,5. Para a obtenção do sobrenadante foi realizada uma centrifugação a 10.000 x g por 15 min. a 4°C. Após, foi realizada a primeira etapa de purificação, obtendo-se a substância parcialmente purificada.

4.3.10.2 Titulação do extrato bruto

Foi utilizado o método da diluição seriada para determinar o número de unidades arbitrárias por mL no sobrenadante bruto. O sobrendante filtrado em filtros com porosidade de 0,22 µm (Millipore Corporation, Bedford, MA, E.U.A.), foi diluído sucessivamente em placas de microtitulação a partir da proporção 1:1 (v/v) em solução fisiológica esterilizada (NaCl 0,85%), tendo-se diluições de 1/2, 1/4 , 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 e assim sucessivamente. Alíquotas de 20 µL dessas diluições foram inoculadas diretamente na forma de um spot na superfície de placas contendo ágar BHI com uma suspensão de 108 células/mL (0,5 na escala de Mac Farland) em solução fisiológica esterilizada (NaCl 0,85%) de Bacillus cereus ATCC

14579 ou de Listeria monocytogenes ATCC 7644. As placas foram incubadas a 37ºC por 24 h. O título designado como UA/mL foi definido como sendo a recíproca da maior diluição que apresentou halo de inibição (KIMURA et al., 1998). Em seguida, a atividade antibacteriana foi calculada e expressa em unidades arbitrárias (UA/mL) empregando-se a fórmula: “UA = título X 1000 µL X v-1 (µ L)” sendo o “v” o volume do extrato utilizado no ensaio (BATDORJ et al., 2006), que foi de normalmente 20 µ L.

4.3.10.3 Técnicas de extração empregadas para a purificação de bacteriocinas e lipopeptídeos

4.3.10.3.1 Extração dos lipopeptídeos e bacteriocinas por precipitação ácida ou por butanol

A extração dos lipopeptídeos no sobrenadante de cultura do Bacillus sp. P5 foi realizada por meio de precipitação ácida de acordo com Cooper et al. (1981) e com Nakano, Marahiel, Zuber (1988). As bacteriocinas foram extraídas com butanol de acordo com KAWULKA et al. (2004) e STEIN (2008).

4.3.10.3.1.1 Extração com butanol do sobrenadante da cultura

A cultura bacteriana foi obtida através de inoculação e crescimento em caldo BHI por 24 h a 37 ºC (pré-inóculo). Após este tempo, fez-se o inóculo a 1% em caldo BHI e em caldo de Landy e incubou-se por diferentes tempos (6h, 30 h e 36h) a 37 º C.

Decorridos estes três diferentes tempos de cultivo do inóculo, centrifugou-se a cultura a 10.000 g, por 10-15 min. a 4ºC. Após, adicionou-se ¼ do volume de n-butanol(Merck) e agitou-se por 1 h com auxílio de um agitador magnético em capela de exaustão química. A mistura foi então transferida para um funil de separação e deixada em temperatura ambiente

overnight.

Posteriormente, a fase orgânica (superior) foi concentrada em vácuo (liofilizada) obtendo-se um resíduo amarelo, que foi suspendido em metanol (10 mL por litro de cultura) e submetido à cromatografia de fase reversa (coluna C18 acoplada ao HPLC).

4.3.10.3.1.2 Extração ácida de lipopeptídeos do sobrenadante da cultura

Os sobrenadantes obtidos conforme descrito no item anterior foram precipitados através da adição de HCl concentrado até pH 2,0. Centrifugou-se por 30 min. a 10000 X g. Dissolveu-se o precipitado em água destilada, ajustando-se o pH para 7,0 com NaOH. Manteve-se a suspensão a 4ºC overnigth, então adicionou-se o mesmo volume de diclorometano e deixou-se em repouso por 30 min. à temperatura ambiente, quando realizou- se nova centrifugação 15 min. a 10000 X g. Retirou-se a fase aquosa (superior) e, após a evaporação do diclorometano obteve-se um precipitado branco que foi dissolvido em 0,5 a 1 ml de etanol e foi utilizado para a etapa cromatográfica (COOPER, 1981; NAKANO; MARAHIEL; ZUBER, 1988).

4.3.10.3.1.3 Extração dos lipopeptídeos com butanol da matriz alimentar Puba (Lote E)

Foram utilizadas duas formas de extração:

a) 20g de massa de puba foram diluídas em 40 mL de água destilada e misturadas com ¼ de butanol deixando-se em agitação overnigth. Após este período, o líquido da porção superior foi separado.

b) 20g de massa de puba foram diluídas em 40 mL de butanol e deixados em agitação por 6-8h. A fase superior foi separada como descrito no item a. Ambas as amostras foram liofilizadas.

4.3.10.3.2 Cromatografia de fase reversa

Os extratos butanólicos e aqueles obtidos por precipitação ácida foram submetidos à cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) (Shimadzu, modelo Prominance, Detector UV: SPD-20A - UV/VIS, injetor: SIL-20A Prominance Auto sampler). As colunas utilizadas foram Shim-Pack CLC-ODS (M) PN22817873-92 C18, 100-Å pore size, 5 µm particle size

column; Shimadzu e SephasilTM Peptide C18 5 µm ST 4.6/250 C18, 100-Å pore size, 5 µm

particle size column; Amersham Pharmacia Biotech.

Nas corridas designadas como de número 1, 2, 7, 13 e 14, as colunas foram equilibradas com a seguinte condição de eluição: de 0-10 min.: fase móvel A (ácido trifluoroacético - TFA 0,05 %v/v em água MiliQ), 10- 40 min: gradiente de 0 - 100 % de fase móvel B (100 % de

acetonitrila - CH3CN) e de 40-50 min: apenas fase móvel B. Nas corridas 4, 5 , 6, 8, 9, 10 e

12 a condição de eluição utilizada para equilibrar as colunas foi de 0-10 min: fase móvel A (TFA 0,05% ) acrescido de CH3CN 100% (8:2 v/v), 10-40 min. utilizou-se um gradiente de

20% a 100 % da fase móvel B (CH3CN 100%) para a separação dos lipopeptideos e de 40-50

min. foi usada apenas a fase móvel B (100 % CH3CN). Uma taxa de fluxo de 1 mL/min. foi

utilizada em todas as corridas. As frações eluidas das colunas foram monitoradas a 220 e 280 nm.

Todas as frações (1 mL) foram coletadas, liofilizadas e suspensas em 50 µL de água ultra pura (mili-Q) para realização do teste de atividade antimicrobiana. As frações que demostraram atividade contra B. cereus ATCC 14579 e/ou contra L.monocytgenes ATCC 7644 foram selecionadase submetidas a espectrometria de massas. Todos os solventes de HPLC foram preparadas diariamente e filtrados sob vácuo antes do uso. Todas as soluções aquosas utilizadas fora preparadas com água ultra pura.

4.3.10.3.3 Preparo das amostras de puba para espectrometria de massas

Os extratos butanólicos obtidos da matriz de puba foram suspendidos em água ultra- pura e submetidos a microcromatografia de fase reversa utilizando-se “ponteiras” Zip Tip®

pipette tips C18 (Millipore, Darmstadt, Alemanha). Cada “ponteira” Zip Tip® foi equilibrada

com 10µ L de ACN 100%, seguida de 10µ L CH3CN 50% /TFA 0,1% e, então, duas vezes

com 10µ L de TFA 0,1%. Após o equilíbrio, a solução contendo os lipopeptídeos extraídos da puba foi pipetada de 5 a 10 vezes e o líquido foi descartado. A “ponteira” Zip Tip® foi lavada três vezes com 10µ L de TFA 0,1% e, logo após, a amostra foi eluída com 5µ L de uma solução de CH3CN 60%/TFA 0,1%. Os eluatos foram analisados por espectrometria de

massas.

4.3.10.3.2.1 Análise dos eluatos por espectometria de massas MALDI-TOF

Os eluatos que apresentaram atividade antimicrobiana contra Bacillus cereus ATCC 14579 e/ou contra Listeria monocytogenes ATCC 7644, bem como aqueles eluatos obtidos diretamente do extrato butanólico de puba, foram submetidos à espectometria de massas utilizando-se um espectômetro de massas com Ionização por Dessorção a Laser Assistida por Matriz - Tempo de vôo (MALDI-TOF, Mass Spectrometer Autoflex III; Bruker Daltonics,

Inc) instalado no Núcleo de Biomoléculas do Departamento de Bioquímica e Imunologia, ICB, UFMG.

Para a determinação de massa molecular foram aplicados na superfície da placa de MALDI (MTP AnchorChips 384x600) 1µL da amostra a ser analisada acrescida de 1µ L da matriz orgânica ácido alfa-ciano-4-hidroxi-cinâmico ou 1µ L da matriz ácido 2-5 dihidroxibenzóico (DHB, Fluka). A cristalização da mistura foi feita à temperatura ambiente. O MALDI-TOF foi operado no modo refletido positivo, usando o software Flex Control 3.3 (Brucker Daltonics , Inc.). A calibração externa foi feita utilizando-se a mistura de peptídeos da Bruker Peptide Calibration Standard II (Brucker Daltonics, Inc.). Uma vez obtidos os valores de massa correspondentes a cada lipopeptídeo presente nas amostras, estes foram submetidos à fragmentação MS/MS, quando possível, e/ou comparadosa fragmentação dos padrões de iturina (Iturin A obtida de Bacillus subtilis, ≥95% (HPLC) e de surfactina (Surfactina obtida de Bacillus subtilis, ≥98% (HPLC and TLC)S3523 (Sigma-Aldrich; St. Louis, EUA).