Purificação e sequenciamento das amostras

Os produtos da PCR foram visualizados por meio de eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com Gel Red® (Biotium), purificadas utilizando-se o kit QIAquick® Gel Extraction (Qiagen) e submetidas a sequenciamento por eletroforese capilar em aparelho ABI3730 (Applied Biosystems), utilizando-se polímero POP7 e BigDye v3.1® (Applied Biosystems). As reações de sequenciamento foram feitas nas duas direções, com os oligonucleotídeos iniciadores da reação secundária. Para determinação da sequência consenso foi utilizado o software Codoncode Aligner versão 4.0.1 (CodonCode Corporation Dedham®, MA, USA). O alinhamento das sequências consenso dos fragmentos amplificados por nPCR foi feito com o auxílio dos programas Clustal W (THOMPSON et al., 1997) e BioEdit Sequence Alignment Editor (HALL, 1999), tomando-se como base sequências homólogas disponíveis no GenBank. As sequências geradas foram depositadas no “Genbank” (MG958615, MG958616, MG958617, MG958618).

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3 Análise estatística

A análise dos dados consistiu de estatística descritiva e inferencial (Teste Exato de Fisher) para verificar associação entre a ocorrência de Giardia com cada uma das variáveis estudadas (consistência fecal e faixa etária). O intervalo de confiança a 95%

foi calculado usando o método Wilson ('Wilson' Score interval) (Sergeant, 2017) e a análise estatística foi considerada significativa quando P<0,05.

4 Resultados

Por meio da nPCR pelo gene ssu rRNA, Giardia spp. foi detectada em 6,56%

(12/183) das amostras fecais dos bezerros analisados em nosso estudo. Das quais, cinco, quatro e três amostras foram positivas pelos genes tpi, bg e gdh, respectivamente (Tabela 3). Em todos os fragmentos sequenciados foi observada 100% de similaridade genética com “assemblage” E de G. duodenalis.

As sequências geradas a partir do gene ssu rRNA apresentaram 100% de similaridade com sequências obtidas de bovinos no Brasil (JF957620), enquanto as sequencias geradas a partir do gene gdh, foram idênticas às sequências já descritas em búfalos (KJ124966) e humanos (KJ124968) no Egito. Adicionalmente, as sequências obtidas a partir dos genes bg e tpi foram idênticas às sequências descritas em búfalos no Egito (KJ125024) e Austrália (KF019197), respectivamente.

Não foi verificada associação significativa com a faixa etária (P = 0,9997) e com a consistência fecal (P = 0,3332) nos búfalos (Tabela 4). Giardia spp. foi detectada em sete leiterias com sistema de manejo extensivo.

TABELA 3. Amostras positivas para Giardia pela nested PCR, de acordo com os marcadores moleculares ssu rRNA, tpi, bg e gdh.

Marcadores genéticos Amostras

a Amostras que foram sequenciadas.

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TABELA 4. Ocorrência de Giardia (gene ssu rRNA) em amostras fecais de bezerros bubalinos de acordo com as variáveis consistência fecal e faixa etária.

Variável Categoria

PCR

Nº Positivos/Nº amostras P**

(% positivos; 95% CI*) Consistência Fecal Normal 7/130 (5,38; 2,63-10,7%)

0,3332

*95% Intervalo de Confiança; **Teste exato de Fisher.

5 Discussão

O nosso estudo representa a primeira detecção molecular de G. duodenalis em bezerros bubalinos no Brasil. A caracterização molecular a partir dos genes ssu rRNA, tpi, bg e gdh revelou a presença de “assemblage” E de G. duodenalis em bezerros bubalinos.

Somente na amostra 2 (Tabela 2) houve amplificação dos quatro genes. O gene ssu rRNA é adequado para a triagem de um grande número de amostras, pois devido ao seu alto número de cópias, confere maior sensibilidade à reação (RYAN; CACCIÒ, 2013; WIELINGA; THOMPSON, 2007). Pelo fato deste locus ser muito conservado para detectar a variabilidade intra “assemblage” (WIELINGA; THOMPSON, 2007), o uso de marcadores mais polimórficos, como bg, tpi e gdh, são necessários (SPRONG;

CACCIÒ; VAN DER GIESSEN, 2009).

Pela nPCR, a partir do gene ssu rRNA foi constatada 7% de positividade. Em estudos anteriores, realizados na Austrália e Sri Lanka, em que foram utilizadas exclusivamente técnicas moleculares, a ocorrência de G. duodenalis foi de 13%

(ABEYWARDENA et al., 2013) e 0,7% (ABEYWARDENA et al., 2014), respectivamente. A ocorrência de Giardia pode variar em decorrência de fatores como a idade dos animais, práticas de manejo, condições climáticas, geográficas, delineamento experimental e de acordo com o teste empregado para o diagnóstico (FENG; XIAO, 2011; GEURDEN; VERCRUYSSE; CLAEREBOUT, 2010).

Assim como em outras pesquisas de G. duodenalis já realizadas em bubalinos, nós realizamos somente uma coleta de amostras fecais e desta forma, a ocorrência pode estar subestimada, uma vez que há a possibilidade da liberação intermitente de cistos deste protozoário, o que já foi verificado em bovinos (APPELBEE et al., 2003;

O’HANDLEY et al., 1999, SANTÍN et al., 2009).

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A presença de G. duodenalis não foi associada à diarreia em nosso estudo e isso já foi observado em bezerros bubalinos (HELMY et al., 2015). A presença de cistos de Giardia em fezes diarreicas não fornece evidências suficientes para concluir que a giardíase é a causa da diarreia em ruminantes, a qual muitas vezes é multifatorial, com mais de um patógeno envolvido (O’HANDLEY; OLSON et al., 2006).

Em nossa pesquisa, observamos G. duodenalis em bezerros bubalinos com até seis meses de idade, sendo que um dos animais positivos pela PCR tinha apenas cinco dias de vida. A giardíase ocorre tipicamente em bovinos com cinco a 10 semanas de idade, mas já foi observada a eliminação de cistos de Giardia em animais a partir de quatro dias de idade(GEURDEN et al., 2006; XIAO; HERD, 1994).

Com base na análise filogenética, todas as sequências obtidas no presente estudo foram classificadas como “assemblage” E, considerado o assemblage dominante na espécie bovina (APPELBEE et al., 2003; ASHER; HOSE; POWER, 2016; DIXON et al., 2011; JIAN et al, 2018; PAZ E SILVA et al., 2012; WANG et al., 2017). Pesquisas com bezerros bubalinos, também verificaram predomínio de

“assemblage” E, em países como Sri Lanka (ABEYWARDENA et al., 2014), Egito (HELMY et al., 2015) e Itália (CACCIÒ et al., 2007), sendo que somente na Austrália o “assemblage” A foi dominante (ABEYWARDENA et al., 2014).

Importante relatar que recentemente, esse “assemblage” foi encontrado em humanos, no Brasil (FANTINATI et al., 2016), Egito (ABDEL-MOEIN; SAEED, 2016;

FORONDA et al., 2008, HELMY, et al., 2015) e Austrália (ZAHEDI et al., 2017).

Com base nestas informações, pode-se inferir sobre a possibilidade de transmissão zoonótica do referido “assemblage”, sendo que os bubalinos podem representar um importante reservatório na epidemiologia desta enfermidade.

Interessante mencionar que G. duodenalis foi detectada somente nas leiterias com sistema extensivo em nosso estudo. Nestas propriedades, os animais tinham acesso a fontes naturais de agua no pasto e talvez isto tenha propiciado a infecção dos bubalinos. Por outro lado, na fazenda em que não encontramos o referido parasito, os animais eram alimentados com concentrado, tendo acesso a piquetes próximos ao curral onde havia bebedouros de água proveniente de poço artesiano.

Embora não tenhamos comparado o mesmo número de leiterias que adotavam sistemas de manejo semelhantes, não podemos descartar a possibilidade da ocorrência do parasito ter sido influenciada pelo tipo de manejo adotado em cada propriedade.

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Os resultados da nossa pesquisa, fornecem informações úteis sobre a prevalência de G. duodenalis em bezerros bubalinos, com detecção de “assemblage”

E que também foi recentemente identificado em seres humanos.

A partir da detecção de G. duodenalis “assemblage” E nestes bezerros bubalinos e as evidências recentes do seu potencial zoonótico, surge a necessidade da realização de investigações moleculares relacionadas às infecções por este parasito em humanos e animais.

6 Conclusão

Nós detectamos G. duodenalis “assemblage” E em bezerros bubalinos de maneira inédita no Brasil.

7 Agradecimentos

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (Projeto 2010/52542-3) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pela bolsa de doutorado concedida a M. C. C. Aquino.

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