Purificação da proteína ExsG

A primeira etapa de purificação da proteína ExsG revelou que a maior parte da proteína não se ligou ao níquel presente na coluna (Figura 24). Com isto, antes de carregar novamente a amostra nesta coluna, foi realizada uma precipitação com duas concentrações de saturação de sulfato de amônio (30% e 50%) afim de aumentar a afinidade da proteína com a coluna de níquel através da desnaturação reversível pela adição de sal (Figura 25).

Figura 24: SDS-PAGE da purificação da proteína ExsG recombinante em coluna de gravidade carregada com níquel. L – load (amostra carregada na coluna), FT – flow through (proteína que não se ligou à coluna), W1 e W2

– lavagens da coluna, E1-E4 – frações eluídas. A seta indica a banda

correspondente à proteína recombinante ExsG mais o His-SUMO-tag (53 kDa). M – marcador molecular (Precision Plus Protein™ Unstained

Standards, Bio-Rad®). Gel de poliacrilamida 15% corado com Coomassie brilliant blue R-250.

Os resultados da purificação em coluna de níquel da fração 30P da precipitação com sulfato de amônio mostraram que a maior parte da proteína se ligou à coluna de níquel. Entretanto, a amostra permaneceu com grande quantidade de contaminantes (Figura 26).

Figura 25: SDS-PAGE da precipitação com sulfato de amônio (SA) da proteína ExsG recombinante. AP – amostra antes da precipitação, 30T – fração total após adição de 30% de SA, 30S – fração sobrenadante após adição de 30% de SA, 30P - fração precipitada após adição de 30% de SA, 50T – fração total após adição de 50% de SA, 50S – fração sobrenadante após adição de 50% de SA, 50P - fração precipitada após adição de 50% de SA. A seta indica a fração onde se encontra a proteína de interesse. Observa-se que uma quantidade considerável de contaminantes foi eliminada. M – marcador molecular (Precision Plus

Protein™ Unstained Standards, Bio-Rad®). Gel de poliacrilamida 15%

corado com Coomassie brilliant blue R-250.

As frações eluídas resultantes da purificação em coluna de níquel foram concentradas, dialisadas e digeridas com SUMO protease afim de se eliminar a His- SUMO-tag. Em seguida, a amostra foi concentrada e carregada em coluna de exclusão por tamanho utilizando a resina Superdex 100 (GE Healthcare). Os resultados mostram que a proteína se tratava de uma agregado, sendo liberada da coluna nas frações anteriores ao esperado (Figura 27). Foi possível separar a His- SUMO-tag da proteína de interesse.

Figura 26: SDS-PAGE da purificação da proteína ExsG recombinante em coluna de gravidade carregada com níquel após precipitação com sulfato de amônio. L – load (amostra carregada na coluna), FT – flow through (proteína que não se ligou à coluna), W1 e W2 – lavagens da coluna, E1-

E3 – frações eluídas. A seta indica a banda correspondente à proteína

recombinante ExsG mais o His-SUMO-tag (53 kDa). M – marcador molecular (Precision Plus Protein™ Unstained Standards, Bio-Rad®). Gel de poliacrilamida 15% corado com Coomassie brilliant blue R-250. Afim de eliminar os contaminantes da amostra resultante da purificação por exclusão de tamanho, esta foi dialisada com uma concentração salina reduzida (100 mM NaCl) para serem utilizadas na cromatografia por troca iônica. Entretanto, toda a amostra precipitou de forma irreversível, se mostrando instável em baixa concentração salina. Outra alternativa foi utilizada a fim de reduzir os contaminantes presentes na amostra. Após sonicação das células (início da purificação) o sobrenadante foi dividido em quatro partes, sendo cada parte purificada isoladamente. Foi obtida uma amostra mais pura, porém com concentração inferior à indicada para os ensaios de cristalização.

Figura 27: SDS-PAGE da purificação da proteína ExsG recombinante em coluna de exclusão por tamanho (Superdex 100, GE Helthcare) após digestão com SUMO protease. L – load (amostra carregada na coluna), 15-20 – frações contendo a proteína ExsG, 27-30 – frações contendo a cauda His-SUMO. A seta indica a banda correspondente à proteína recombinante ExsG (37 kDa) e a seta pontilhada indica a banda correspondente à His-SUMO-tag (16 kDa). M – marcador molecular (Precision Plus Protein™ Unstained Standards, Bio-Rad®). Gel de poliacrilamida 15% corado com Coomassie brilliant blue R-250.

Diante disto, após a cromatografia por exclusão de tamanho as amostras foram concentradas, quantificadas e utilizadas nos ensaios iniciais de cristalização (Figura 28). Concentrações suficientes de proteína foram obtidas (10- 15 mg/mL). Apesar de contaminadas pela presença de outras proteínas, a amostras foram apropriadas para o uso, pois continham mais de 90% da proteína de interesse.

Figura 28: SDS-PAGE da proteína exsG concentrada após purificação em cromatografia por exclusão de tamanho. FT – flow through (volume que passou pelo filtro Amicon de 30 kDa), S – amostra concentrada da proteína ExsG recombinante (37 kDa). A seta indica a banda correspondente à proteína ExsG. Observa-se a presença de contaminantes, entretanto, mais de 90% da amostra corresponde à proteína de interesse. M – marcador molecular (Precision Plus

Protein™ Unstained Standards, Bio-Rad®). Gel de poliacrilamida 15%

corado com Coomassie brilliant blue R-250. 5.3.6 Ensaios cristalográficos

Os ensaios cristalográficos utilizando a proteína ExsG foram satisfatórios, sendo observadas duas condições promissoras a serem refinadas para obtenção do cristal único. Estas condições apresentaram “oily drops” ou gotas oleosas, estruturas consideradas propícias para a formação do cristal. A partir destas duas condições, refinamentos em placas de 24 poços estão sendo realizados a fim de se obter cristais únicos refratáveis.

6 CONCLUSÕES

Com o presente estudo pôde-se avançar no conhecimento do sistema de dois componentes ExsF/ExsG, ainda predito em Xac. Os testes de expressão gênica,

patogenicidade, crescimento bacteriano in vitro e in planta, e produção de biofilme, realizados com o mutante duplo para estes dois genes sugerem fortemente que estes genes estão relacionados com a patogenicidade da bactéria.

O sistema de dois componentes ExsF/ExsG regula positivamente a produção de biofilme, fundamental no processo patogênico bacteriano. Seu nocaute reduziu significativamente a produção de biofilme em Xac.

Os resultados obtidos nos ensaios cristalográficos iniciais para a proteína ExsG foram promissores, podendo gerar futuros resultados de cristalização para esta proteína.

Estudos globais como análise transcriptômica e proteômica podem auxiliar no maior entendimento das funções do sistema ExsF/ExsG e sua importância na manutenção e patogenicidade de Xac.

7 REFERÊNCIAS

ALFANO, J. R.; COLLMER, A. The type III (Hrp) secretion pathway of plant pathogenic bacteria: trafficking harpins, Avr proteins, and death. Journal of Bacteriology, Washington DC, v. 179, n. 18, 1997.

AMARAL, A. M.; TOLEDO, C. P.; BAPTISTA, J. C.; MACHADO, M. A. Transformation of Xanthomonas axonopodis pv. citri by electroporation. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 30, p. 292-294. 2004. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1590/S0100-41582005000300013>.

AMORIM, L.; BERGAMIN FILHO, A. A epidemiologia do cancro cítrico. Summa Phytopathologica, Botucatu, v. 27, n. 1, p. 151-156, 2001.

AZEVÊDO, C. L. L. Sistema de Produção de Citros para o Nordeste. Cruz das Almas: Embrapa: CNPMF, 2003. 49 p. (Embrapa-CNPMF. Sistema de Produção, 16).

BARBOSA, J.C.; GIMENES-FERNANDES, N.; MASSARI, C. A.; AYRES, A. J. Incidência e distribuição de cancro cítrico em pomares comerciais do Estado de São Paulo e sul do Triângulo Mineiro. Summa Phytopathologica, Botucatu, v. 27, p. 30- 35, 2001.

BAPTISTA, J. C.; MACHADO, M. A.; HOMEM, R. A.; TORRES, P. T.; VOJNOV, A. A.; AMARAL, A. M. Mutation in the xpsD gene of Xanthomonas axonopodis pv. citri affects cellulose degradation and virulence. Genetics and Molecular Biology, Ribeirão Preto, v. 33, n. 1, p. 146-153, 2010.

BERKS, B. C.; PALMER, T.; SARGENT, F. The Tat protein translocation pathway and its role in microbial physiology. Advances in Microbiology Physiology, Washington DC, v. 47, p. 187-254, 2003. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/S0065-2911(03)47004-5>.

BITANCOURT, A. A. O cancro cítrico. O Biológico, São Paulo, v. 23, p.101-111, 1957.

BRUNINGS, A. M; GABRIEL, D. W. Xanthomonas citri: breaking the surface. Molecular Plant Pathology, London, v. 4, n. 3, 141-157, 2003. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1046/j.1364-3703.2003.00163.x>.

BÜTTNER, D; BONAS, U. Getting across-bacterial type III effector proteins on their way to the plant cell. EMBO Journal, New York, v. 2, n. 20, p. 5313-5322, 2002. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1093/emboj/cdf536>.

BÜTTNER, D.; BONAS, U. Regulation and secretion of Xanthomonas virulence factors. FEMS Microbiology Reviews, Delft, v. 34, n. 2, p. 107-133, 2010. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1111/j.1574-6976.2009.00192.x>.

CHAGAS, M. C. M.; PARRA, J. R. P.; NAMEKATA, T.; HARTUNG, J. S.; YAMAMOTO P. T. Phyllocnistis citrella Stainton (Lepidoptera: Gracillariidae) and its relationship with the citrus canker bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri in Brazil. Neotropical Entomology, Londrina, v. 30, n. 1, p. 55-59, 2001. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1590/S1519-566X2001000100009>.

CHEN, Y-Y.; WU, C-H.; LIN, J-W.; WENG, S.F.; TSENG, Y-H. Mutation of the gene encoding a major outer-membrane protein in Xanthomonas campestris pv.

campestris causes pleiotropic effects, including loss of pathogenicity. Microbiology, Reading, v. 156, n. 9, p. 2842-2854, 2010. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1099/mic.0.039420-0>.

CITRUS BR – Associação Nacional dos Exportadores de Sucos Cítricos. Comércio - Exportações Brasileiras. Disponível em <http://www.citrusbr.com/>. Acesso em: 22 jul. 2014.

CONAB – Companhia Nacional de Abastecimento. Acompanhamento da Safra Brasileira de Laranja, Terceiro Levantamento. Brasília: CONAB, 2013. 11 p.

CROZIER, A.; KAMIYA, Y.; BISHOP, G.; YOKOTA, T. Biosynthesis of hormones and elicitor molecules. In: BUCHANAN, B. B.; GRUISSEM, W.; JONES, R. L. Biochemistry and Molecular Biology of Plants. Maryland USA: American Society of Plants Physiologists, p. 850-829, 2001.

DA SILVA, A. C.; FERRO, J. A.; REINACH, F. C.; FARAH, C. S.; FURLAN, L. R.; QUAGGIO, R. B.; MONTEIRO-VITORELLO, C. B.; VAN SLUYS, M. A.; ALMEIDA, N. F.; ALVES, L. M.; DO AMARAL, A. M.; BERTOLINI, M. C.; CAMARGO, L. E.; CAMAROTTE, G.; CANNAVAN, F.; CARDOZO, J.; CHAMBERGO, F.; CIAPINA, L. P.; CICARELLI, R. M.; COUTINHO, L. L.; CURSINO-SANTOS JR; EL-DORRY, H.; FARIA, J. B.; FERREIRA, A. J.; FERREIRA, R. C.; FERRO, M. I.; FORMIGHIERI, E. F.; FRANCO, M. C.; GREGGIO, C. C.; GRUBER, A.; KATSUYAMA, A. M.; KISHI, L. T.; LEITE, R. P.; LEMOS, E. G.; LEMOS, M. V.; LOCALI, E. C.; MACHADO, M. A.; MADEIRA, A. M.; MARTINEZ-ROSSI, N. M.; MARTINS, E. C.; MEIDANIS, J.; MENCK, C.

F.; MIYAKI, C. Y.; MOON, D. H.; MOREIRA, L. M.; NOVO, M. T.; OKURA, V. K.; OLIVEIRA, M. C.; OLIVEIRA, V. R.; PEREIRA, H. A.; ROSSI, A.; SENA, J. A.; SILVA, C.; DE SOUZA, R. F.; SPINOLA, L. A.; TAKITA, M. A.; TAMURA, R. E.; TEIXEIRA, E. C.; TEZZA, R. I.; TRINDADE DOS SANTOS, M.; TRUFFI, D.; TSAI, S. M.; WHITE, F. F.; SETUBAL, J. C.; KITAJIMA, J. P. Comparison of the genomes of two Xanthomonas pathogens with differing host specificities. Nature, London, v. 417, n. 6887, p.459-463, 2002. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1038/417459a>.

DUNGER, G.; GAROFALO, C. G.; GOTTIG, N.; GARAVAGLIA, B. S.; ROSA, M.C.; FARAH, C. S.; ORELLANO, E. G.; OTTADO, J. Analysis of three Xanthomonas

axonopodis pv. citri effector proteins in pathogenicity and their interactions with host

plant proteins. Molecular Plant Pathology, London, v. 13, p. 865-876, 2012. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1111/j.1364-3703.2012.00797.x>. FEICHTENBERGER, E.; BASSANEZI, R. B.; SPÓSITO, M. B.; BELASQUE JR, J. Doenças dos citros. In: KIMATI, H.; AMORIM, L.; REZENDE, J. A. M.; BERGAMIN FILHO, A.; CAMARGO, L. E. A. Manual de fitopatologia. 4 ed. São Paulo: Agronômica Ceres, 2005.

FUNDECITRUS – Fundo de defesa da citricultura. O controle nas mãos do citricultor. Citricultor, Araraquara: FUNDECITRUS, 2013. 16 p. (Revista, 16).

GOTTIG, N.; GARAVAGLIA, B. S.; GAROFALO, C. G.; ORELLANO, E. G.; OTTADO, J. A filamentous hemagglutinin-like protein of Xanthomonas axonopodis pv. citri, the phytopathogen responsible for citrus canker, is involved in bacterial virulence. PLoS ONE, New York, v. 4, n. e4358, p. 1-12, 2009. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0004358>.

GOTTIG, N.; GARAVAGLIA, B. S.; GAROFALO, C. G.; ZIMARO, T.; SGRO, G. G.; FICARRA, F. A.; DUNGER, G.; DAURELIO, L. D.; THOMAS, L.; GEHRING, C.; ORELLANO, E. G.; OTTADO, J. Mechanisms of infection used by Xanthomonas

axonopodis pv. citri in citrus canker disease. In: MENDZ-VILAS, A. Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, Formatex Research Center: Badajoz, 2010. 196-204. GOTTWALD, T. R.; TIMMER, L. W. The efficacy of windbreaks in reducing the spread of citrus canker caused by Xanthomonas campestris pv. citri. Tropical Agriculture, Saint Augustine, v. 72, p. 194-201, 1995.

GOTTWALD, T. R.; SUN, X.; RILEY, T.; GRAHAM, J. H.; FERRANDINO, F.; TAYLOR, E. L. Geo-referenced spatiotemporal analysis of the urban citrus canker epidemic in Florida. Phytopathology, Saint Paul, v. 92, p. 361-377, 2002. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1094/PHYTO.2002.92.4.361>.

GRAHAM, J. H.; GOTTWALD, T. R.; CUBERO, J.; ACHOR, D. S. Xanthomonas

axonopodis pv. citri: factors affecting successful eradication of citrus canker.

Molecular Plant Pathology, London, v. 5, n. 1, p. 1-15, 2004. Disponível em:

<http://dx.doi.org/10.1046/j.1364-3703.2004.00197.x>.

GREBE, T. W.; STOCK, J. B. The histidine protein kinase superfamily. Advances in Microbial Physiology, New York, v. 41, p. 139-227, 1999.

GUO, Y.; FIGUEIREDO, F.; JONES, J.; WANG, N. HrpG and HrpX play global roles in coordinating different virulence traits of Xanthomonas axonopodis pv. citri. Molecular Plant-Microbe Interactions, Saint Paul, v. 24, n. 6, p. 649-661, 2011. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1094/MPMI-09-10-0209>.

GUTTENPLAN, S. B.; KEARNS, D. B. Regulation of flagellar motility during biofilm formation FEMS Microbiology Reviews, Delft, v. 37, p. 849-871, 2013. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1111/1574-6976.12018>.

HUANG, T-P.; LU, K-M.; CHEN, Y-H. A novel two-component response regulator links rpf with biofilm formation and virulence of Xanthomonas axonopodis pv. citri. PloS One, New York, v. 8, n. 4, p. 1-11, 2013. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0062824>.

HUGUET, E.; HAHN, K.; WENGELNIK, K.; BONAS, U. hpaA mutants of

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria are affected in pathogenicity but retain the

ability to induce host-specific hypersensitive reaction. Molecular Microbiology, Hoboken, v. 29, n. 6, p. 1379-1390, 1998.

JACOB, T. L. Análise da expressão dos genes pertencentes aos sistemas secretórios Tipo III e Tipo IV e genes pthAs em Xanthomonas citri subsp. citri sob condições infectante e não infectante. 2009. 91f. Dissertação (Mestrado em Agronomia) – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Jaboticabal, 2009.

JACOB, T. R.; LAIA, M. L.; FERRO, J. A.; FERRO, M. I. T. Selection and validation of reference genes for gene expression studies by reverse transcription quantitative

PCR in Xanthomonas citri subsp. citri during infection of Citrus sinensis. Biotechnology Letters, New York, v. 33, p. 1177-1184, 2011. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1007/s10529-011-0552-5>.

JALAN, N.; YAN, Q.; KOGENARU, S.; GUO, Y.; JONES, J. B.; GRAHAM, J. H.; WANG, N. Genomic of Xanthomonas citri and related species. In: GROSS, D. C.; LICHENS-PARK, A.; KOLE, C. Genomics of plant-associated bacteria. Springer: New York, 2014. 151-176.

KEYZER, J.; VAN DER DOES, C.; DRIESSEN, A. J. The bacterial translocase: a dynamic protein channel complex. Cellular and Molecular Life Sciences, Basel, v. 60, n. 10, p. 2034-2052, 2003. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1007/s00018- 003-3006-y>.

KLEMENT, Z. Hypersensitivity. In: MOUNT, M. S.; Lacy, G. H. Phytopathogenic Prokaryotes. New York: Academic Press, 1982. p. 149-177.

KOIZUMI, M. Citrus canker: the world situation. In: TIMMER, L. W. Citrus Canker: an international perspective. Citrus Research & Education Center, University of Florida, Lake Alfred, 1985. p. 2-7.

LAIA, M. L.; MOREIRA, L. M.; DEZAJACOMO, J.; BRIGATI, J. B.; FERREIRA, C. B.; FERRO, M. I. T.; SILVA, A. C. R.; FERRO, J. A.; OLIVEIRA, J. C. F. New genes of

Xanthomonas citri subsp. citri involved in pathogenesis and adaptation revealed by a

transposon-based mutant library. BMC Microbiology, London, v. 9, n. 12, p. 1-17, 2009. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1186/1471-2180-9-12>.

LEE, J.; LEE, H-J.; SHIN, M-K.; RYU, W-S. Versatile PCR-mediated insertion or deletion mutagenesis. BioTechniques, Erlangen, v. 36, p. 398-400, 2004.

LEITE JUNIOR, R. P. Cancro cítrico: prevenção e controle no Paraná. Londrina: IAPAR, 1990. 51 p. (IAPAR. Circular, 61).

LI, J.; WANG, N. Genome-wide mutagenesis of Xanthomonas axonopodis pv. citri reveals novel genetic determinants and regulation mechanisms of biofilm formation. PLoS ONE, New York, v. 6, n. 7, p. 1-6, 2011. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0021804>.

MOREIRA, L. M.; ALMEIRA JR, N. F.; POTNIS, N.; DIGIAMPIETRI, L. A.; ADI, S. S.; BORTOLOSSI, J. C.; DA SILCA, A. C.; DA SILVA, A. M.; MORAES, F. E.;

OLIVEIRA, J. C.; SOUZA, R. F.; FACINCANI, A. P.; FERRAZ, A. L.; FERRO, M. I.; FURLAN, L. R.; GIMENEZ, D. F.; JONES, J. B.; KITAJIMA, E. W.; LAIA, M. L.; LEITE JUNIOR, R. P.; NISHIYAMA, M. Y.; RODRIGUES NETO, J.; NOCITI, L. A.; NORMAN, D. J.; OSTROSKI, E. H.; PEREIRA JUNIOR, H. A.; STASKAWICZ, B. J.; TEZZA, R. I.; FERRO, J. A.; VINATZER, B. A.; SETUBAL, J. C. Novel insights into the genomic basis of citrus canker based on the genome sequences of two strains of

Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii. BMC Genomics, New York, v. 11, n. 238, p. 1-25, 2010. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1186/1471-2164-11-238>.

NAGASAWA, S.; TOKISHITA, S.; AIBA, H.; Mizuno, T. A novel sensor–regulator protein that belongs to the homologous family of signal transduction proteins involved in adaptive responses in Escherichia coli. Molecular Microbiology, Hoboken, v. 6, p. 799-807, 1992.

NEVES, M.F.; TROMBIN, V.G.; MILAN, P.; LOPES, F.F.; CRESSONI, F.; KALAKI, R. Retrato da Citricultura Brasileira. Ribeirão Preto: MARKESTRAT - Centro de Pesquisa e Projetos em Marketing e Estratégia, 2010. 137 p.

PADMANABHAN, D.; VIDHYASEKARAN, P.; RAJAGOPALAN, C. K. S. Changes in photosynthesis and carbohydrate content in canker and halo regions in

Xanthomonas citri infected citrus leaves. Indian Journal of Phytopathology, Deli, v. 26, p. 215-217, 1974.

PARKINSON, N.; ARITUA, V.; HEENEY, J.; COWIE, C.; BEW, J.; STEAD, D. Phylogenetic analysis of Xanthomonas species by comparison of partial gyrase B gene sequences. International Journal Systematic and Evolution Microbiology,

London, v. 57, 2881-2887, 2007. Disponível em:

<http://dx.doi.org/10.1099/ijs.0.65220-0>.

QIAN, W.; JIA, Y.;REN, S. X; HE, Y. Q.; FENG, J. X.; LU, L. F.; SUN, Q.; YING, G.; TANG, D. J.; TANG, H.; WU, W.; HAO, P.; WANG, L.; JIANG, B. L.; ZENG, S.; GU, W. Y.; LU, G. RONG, L.; TIAN, Y.; YAO, Z.; FU, G.; CHEN, B.; FANG, R.; QIANG, B.; CHEN, Z.; ZHAO, G. P.; TANG, J. L.; HE, C. Comparative and functional genomic analyses of the pathogenicity of phytopathogen Xanthomonas campestris pv.

campestris. Genome Research, New York, v. 15, n. 5, p. 757-767, 2005. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1101/gr.3378705>.

QIAN, W.; HAN, Z-J.; HE, C. Two-component signal transduction systems of

Xanthomonas spp.: a lesson from genomics. Molecular Plant-Microbe Interactions, Saint Paul,v. 21, n. 2, p. 151-161, 2008. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1094/MPMI -21-2-0151>.

RODRIGUES NETO, J.; RIBEIRO, J. G. B. Manual técnico de procedimentos do cancro cítrico. Brasília: MAPA/SDA/DDIV, 2002. 66p.

RYAN, R. P.; VORHÖLTER, F. J.; POTNIS, N.; JONES, J. B.; SLUYS, M-A. V.; BOGDANOVE, A. J.; DOW, J. M. Pathogenomics of Xanthomonas: understanding bacterium–plant interactions. Nature Reviews Microbiology, London, v. 9, p. 344- 355, 2011. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1038/nrmicro2558>.

SALMOND, G. P.; REEVES, P. J. Membrane traffic wardens and protein secretion in Gramnegative bacteria. Trends in Biochemical Science, Cambridge, v. 18, p. 7-12, 1993.

SANCHES, A. L. R. Análise Econômica da prevenção e controle do cancro cítrico em São Paulo: uma aplicação da análise benefício-custo. 2012. 109 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Piracicaba, 2012.

SCHAAD, N. W.; POSTNIKOVA, E.; LACY, G. H.; SECHLER, A.; AGARKOVA, I.; STROMBERG, P. E.; STROMBERG, V. K.; VIDAVER, A. K. Reclassification of

Xanthomonas campestris pv. citri (ex Hasse 1915) dye 1978 forms A, B/C/D, and E

as X. smithii subsp. citri (ex Hasse) sp. nov. nom. rev. comb. nov., X. fuscans subsp.

aurantifolii (ex Gabriel 1989) sp. nov. nom. rev. comb. nov., and X. alfalfae subsp. citrumelo (ex Riker and Jones) Gabriel et al., 1989 sp. nov. nom. rev. comb. nov.; X. campestris pv. malvacearum (ex smith 1901) dye 1978 as X. smithii subsp. smithii

nov. comb. nov. nom. nov.; X. campestris pv. alfalfae (ex Riker and Jones, 1935) dye 1978 as X. alfalfae subsp. alfalfae Silva et al. 92 jb (ex Riker et al., 1935) sp. nov. nom. rev.; and “var. fuscans” of X. campestres pv. phaseoli (ex Smith, 1987) dye 1978 as X. fuscans subsp. fuscans sp. nov. Systematic and Applied Microbiology, Berlin, v. 28, p. 494-518, 2005. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.syapm.2005.03.017>.

SENA-VÉLEZ, M.; REDONDO, C.; GELL, I.; FERRAGUD, E.; JOHNSON, E.; GRAHAM, J. H. CUBERO, J: Biofilm formation and motility of Xanthomonas strains with different citrus host range. Plant Pathology, London, p. 1-9, 2014. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1111/ppa.12311>.

SPIEGEL-ROY, P; GOLDSCHMIDT, E. E. The Biology of Horticultural Crops (Biology of Citrus). Cambridge: Cambridge University Press, 1996. p. 244.

STALL, R. E.; SEYMOUR, C. P. Canker: a threat to citrus in the Gulf Coast states. Plant Disease, Saint Paul, v. 67, p. 581-585, 1983. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1094/PD-67-581>.

STOCK, A. M.; ROBINSON, V. L.; GOUDREAU, P. N. Two-component signal transduction. Annual Review of Biochemistry, Palo Alto, v. 69, p. 183-215, 2000. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1146/annurev.biochem.69.1.183>.

TAYLOR, B. L; ZHULIN, I. B. PAS domains: internal sensors of oxygen, redox pontencial, and light. Microbiology and Molecular Biology Reviews, Washington DC, v. 63, n. 2, p. 479-506, 1999.

TAZIMA, Z. H.; NEVES, C. S. V. J.; YADA, I. F. U.; LEITE JUNIOR, R. P. Comportamento de clones de laranja ‘Valência’ na região norte do Paraná. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v. 30, p. 970-974, 2008. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1590/S0100-29452008000400022>.

WENGELNIK, K.; MARIE, C.; RUSSEL, M.; BONAS, U. Expression and localization of HrpA1, a protein of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria essential for pathogenicity and induction of the hypersensitive reaction. Journal of Bacteriology, Washington D. C., v. 178, n. 4, p. 1061-1069, 1996.

WENGELNIK, K.; ACKERVEKEN, V. D.; BONAS, U. HrpG, a key hrp regulatory protein of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria is homologous to two-component response regulators. Molecular Plant-Microbe Interactions, Saint Paul, v. 9, n. 8, p. 704-712, 1996.

WEST, A. H.; STOCK, A. M. Histidine kinases and response regulator proteins in two-component signaling systems. Trends in Biochemical Science, Cambridge, v. 26, p. 369-376, 2001. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/S0968- 0004(01)01852-7>.

YAMAZAKI, A.; HIRATA, H.; TSUYUMU, S. HrpG regulates type II secretory proteins in Xanthomonas axonopodis pv. citri. Journal of General Plant Pathology, Tokyo, v. 74, p. 138-150, 2008. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1007/s10327-008-0075- 7>.

YAN, Q.; WANG, N. The ColR/ColS two-component system plays multiple roles in the pathogenicity of the citrus canker pathogen Xanthomonas citri subsp. citri. Journal of Bacteriology, Washington D. C., v. 193, n. 7, p. 1590-1599, 2011. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1128/JB.01415-10>.

ZHANG, S-S; HE, Y-Q.; XU, L. M.; CHEN, B-W.; JIANG, B-L.; LIAO, J.; CAO, J-R.; LIU, D.; HUANG, Y-Q.; TANG, D-J.; Lu, G-T.; TANG, J-L. A putative colRXC1049-

colSXC1050 two-component signal transduction system in Xanthomonas campestris positively regulates hrpC and hrpE operons and is involved in virulence, the hypersensitive response and tolerance to various stresses. Research in Microbiology, New York, v. 159, p. 569-578, 2008. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.resmic.2008.06.010>.

ZIMARO, T.; THOMAS, L.; MARONDEDZE, C.; GARAVAGLIA, B. S.; GEHRING, C.; OTTADO, J.; GOTTIG, N. Insights into Xanthomonas axonopodis pv. citri biofilm through proteomics. BMC Microbiology, London, v. 13, n. 186, p. 1-14, 2013. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1186/1471-2180-13-186>.

APÊNDICE

Apêndice A – Resultados da quantificação e integridade do RNA.

Apêndice B – Resultados da titulação dos oligonucleotídeos do experimento de PCR em tempo real.

Apêndice C – Resultados da curva padrão do experimento de PCR em tempo real. Apêndice C – Resultados da análise dos genes de referências utilizados no experimento de PCR em tempo real.

Apêndice A – Quantificação e integridade do RNA

As análises realizadas no equipamento NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific) utilizando os RNAs totais extraídos de Xac mostraram que estes apresentaram relações 260/230 e 260/280 satisfatórias e concentrações suficientes para serem utilizadas no experimento (200 ng/µL a 2.500 ng/µL). Já a análise no Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen), utilizando o Qubit dsDNA HS Assay kit (Invitrogen), revelou que as amostras possuíam contaminação com DNA genômico inferior a 10%, valor considerado adequado na avaliação da pureza do RNA.

A análise da integridade do RNA, realizada através do aparelho Agilent 2100

Bioanalyzer (Agilent Technologies), revelou que as amostras de RNA estavam

íntegras, com valores de RIN de 7,9 a 10. A Figura 1A ilustra os eletroferogramas de algumas amostras de RNA de Xac obtidos através do programa 2100 Expert

Software (Agilent Technologies).

A etapa de extração de RNA é fundamental para o desenvolvimento de experimentos envolvendo a técnica de qRT-PCR. RNAs com baixa qualidade não