Purificação

As proteínas recombinantes produzidas a partir da cultura de transfectomas estáveis obtidos como descrito acima, foram concentrados e purificados por cromatografia de afinidade, através da coluna ImmunoPure Plus Immobilized Protein A (Pierce®). Essa coluna apresenta a proteína A conjugada a sefarose. A proteína A tem a capacidade de se ligar a um grande número de moléculas de superfície celular, além das imunoglobulinas, tais como receptores de Fc do tipo II (FcR-II), moléculas de adesão, receptor do fator de crescimento do endotélio vascular, receptor de célula T (TCR), antígenos HLA-AB entre outros. Pertencentes a superfamília gênica das Imunoglobulinas e possuem domínios “Ig-like” (regiões homólogas aos domínios constantes ou variáveis das imunoglobulinas), que possuem afinidade pela proteína A (Vanamala et al., 2003). Logo, pode ser utilizada na purificação de fragmentos de anticorpos que contenham os domínios CH2-CH3 de Imunoglobulinas, como os FvFc.

Após a purificação, os sobrenadantes foram concentrados utilizando a membrana de celulose Centricon da Millipore. YM-30 (Millipore), com exclusão de 30 kDa, e dialisadas para se trocar o tampão para PBS. As frações coletadas da coluna foram analisadas quanto à presença das proteínas recombinantes por ensaio de Dot Blot (Figura 19). O resultado apresentado

indica que a purificação foi bem sucedida e que as proteínas foram concentradas em uma única fração.

Figura 19: Imunodetecção dos FvFcs após purificação e concentração. Dois microlitros de cada fração

coletada foram aplicados em membrana de nitrocelulose e a presença dos FvFcs recombinantes foi detectada com anti-Fc humana conjugado a fosfatasse alcalina. P-H; purificação da versão H. P-O: purificação da versão O. P-L: purificação da versão L. P-A: purificação da versão A. C+: Controle positivo com 1 μg de IgG humana.

C-: Controle negativo.

A quantificação dos FvFcs foi feita a partir da obtenção de uma curva padrão com concentrações conhecidas de IgG humana (Figura 20). Com base na equação da reta obtida pela curva padrão calculou-se que a concentração dos FvFcs foram de: 752 ng para versão H 2,063 ng para versão O, e 513 ng para versão L e 175ng para a versão A.

Figura 20: Curva-padrão para quantificação por ELISA. O gráfico apresenta a linha tendência da quantificação do padrão de IgG humana utilizado. A partir desse gráfico foi obtida a equação da reta, que foi usada para estimar a concentração dos FvFc purificados.

y = 0,0068x + 0,1131 R² = 0,9977 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 A b s (4 0 5 n m ) Concentração de anticorpo em ug

Os resultados obtidos não correspondem ao demostrado na literatura para expressão de proteínas recombinantes em células aderidas utilizando-se vetores com o promotor CMV (Kim et al., 2012; Mus-Veteau, 2010), podendo ser devido ao acúmulo de amônia e lactato, que é um produto do lixo tóxico gerado pelo metabolismo celular (glicoses) e fonte de energia (tais com a glutamina). Propondo-se assim que as condições dos meios de cultura são de grande importância para manutenção das células de mamífero e um fator importante que pode afetar uma ótima produção de proteínas recombinantes, somando ao fato que no processo de purificação por cromatografia de afinidade com a coluna ImmunoPure Plus Immobilized Protein A (Pierce®) na bancada não se obteve uma taxa de recuperação esperada para o volume de sobrenadante de cultura purificada, sendo essa de apenas 1%, após verificação das condições requeridas e do Ph dos tampões s utilizados. Essa porcentagem de recuperação foi aumentada para 20% com a utilização do equipamento AKTA purifier (GE Healthcare). Mesmo com esse ganho, considera-se uma taxa baixa de recuperação.

Sabe-se que a proteína A é um excelente ligante na cromatografia de afinidade, a desnaturação das IgG por contato com a proteína A é conceitualmente paralelo ao fenómeno de ajuste induzido nos sistemas de enzima-substrato. A IgG é desnaturada para entrar em consenso com a topografia química da proteína A(Deisenhofer, 1981) ), a que é um ligante de proteína eletronegativo geralmente hidrofóbico e confere sua elevada especificidade e afinidade para IgG(Langone, 1982). Outra característica cromatográfica importante é a capacidade de desnaturação ao primeiro contato, o que aumenta a sensibilidade de Cγ2 ao composto desnaturação (tampão) após a exposição a um pH de 3,5, portanto eliminando a necessidade de condições mais extremas de eluição impostas por outros ligantes de afinidade biológica, tais como a proteína L, a proteína G e de imunoafinidade. Pesquisas mostram que o segundo domínio constante (Cγ2) de IgG colapsa completamente a pH 3, isto faz com que as nossas condições de eluição de proteína por cromatografia de afinidade propostas preocupantes, dado que geralmente a faixa de pH é de 2-3 para proteína G, e para anticorpos eluidos a partir de proteína A a eluição deve ser feita a um pH de 3,5 ou mais, e especialmente, a atual geração de proteínas recombinantes que se ligam à proteína A apenas pela região Fc(Gagnon, 1996).

Foi demostrado em pesquisas recentes uma eluição mais eficiente quando a molécula de IgG encontra-se numa conformação mais reduzida apresentando uma configuração dobrada; A flexibilidade inerente da dobradiça é aumentada pela flexibilidade imposta pelo composto de desnaturação sob condições ácidas, o que permite que a região Fab entre em contato com o domínio Cγ3(Latypov et al., 2012).

Assim também foi confirmado que o tamanho hidrodinâmico da IgG é aumentado de acordo com a concentração de NaCl até mesmo a pH baixo, diminuindo drasticamente a sua recuperação pós-purificação (Gagnon et al., 2015); Considerando que o nosso tampão de eluição contém grande quantidade de NaCl, isso poderia ser outra causa pelo qual obtivemos uma baixa recuperação, isto pode-se resolver com a adição de arginina para melhorar a eluição da IgG da Proteína A, especificamente, porque ela relaxa interações hidrofóbicas (Arakawa et al., 2004) O seu resíduo guanida - um análogo de guanidina - também conhecido por ser um forte dador-aceptor de hidrogênio, permite à arginina uma melhor recuperação de que a obtida com NaCl as ligações de hidrogénio e interações hidrofóbicas, em parte, compensa o aumento no tamanho da IgG, em contraste com NaCl, que agrava os efeitos sobre o tamanho do IgG. Outra maneira de enfrentar e resolver esse problema é a implementação de protocolos automatizados que são eficientes em tempo e custo permitindo uma purificação de alto desempenho, usando protocolos de cromatografia de troca aniônica e etapas de cromatografia de troca iônica, troca de tampão, e cromatografia de interação hidrófoba para obter taxas de até 70% de rendimento global(Camper and Viola, 2009)

Após a quantificação, as mostras foram analisadas por meio de um sistema de microeletroforese usando nanocapilares (Bioanalyzer), para determinar o grau de pureza e confirmação da sua quantificação. As amostras foram eletroforeticamente separadas nos microcanais preenchidos com solução polimérica. A detecção foi baseada na fluorescência induzida a laser por um corante fluorescente que foi adicionado à solução polimérica e ligado, não covalentemente, às micelas proteína-SDS. O software Bioanalyzer calcula automaticamente o tamanho e a concentração de cada pico separado e expõe os resultados em tempo real. A quantidade de proteína recombinante nas amostras expressa como a porcentagem de proteína total pode ser determinada diretamente da tabela dos resultados fornecida pelo software. Os resultados obtidos por GelChip-CE foram comparados com

aqueles obtidos por gel de eletroforese convencional (15% SDSPAGE). Analisando o gel e os histogramas para cada uma das amostras podemos observar um alto grau de pureza das proteínas purificadas (Tabela 4), não sendo possível a detecção de contaminantes; Pode-se observar as bandas de 67 kDa correspondente à os FvFcs (Figura 21).

FVFC

% PUREZA

CHO

HEK

H

100

75

O

80

53

L

100

60

A

66

50

Tabela 4: Porcentagem de pureza de FvFc purificados

Figura 21: Análise da purificação dos FvFc por GelChip-CE. Bioanalyzer. Baseada na fluorescência

induzida a laser de um corante fluorescente, no qual foi adicionado na matriz de separação. As amostras foram separadas individualmente em uma solução polimérica apropriada fornecida pelo kit Protein 200 Plus LabChip, como recomendado pelo fabricante. MM é o padrão de massa molecular. A molécula FvFc migra como um monómero de 67 kDa, podemos observar a formação desta bandas correspondentes aos FvFc.

Posteriormente, os FvFcs foram submetidos à eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE) e analisadas por Wersten-Blot (Figura 22). Para a detecção dos FvFcs recombinantes utilizou-se um anticorpo anti-Fc humana conjugado à fosfatase alcalina e a revelação foi feita com NBT/BCIP. Observou-se uma banda de aproximadamente 67 kDa que corresponde ao tamanho esperado para o FvFc após a redução e separação do dímero.

Figura 22. Análise dos FvFcs produzidos por Western Blot: Foi realizada uma eletroforese em gel SDS- PAGE 10% para separação das proteínas purificadas as quais eram posteriormente transferidas para uma membrana de nitrocelulose e revelada com IgG de coelho e anti-IgG de coelho conjugado a fosfatase alcalina. 1- IgG humana utilizada como controle positivo. 2 – Rituximabe. 3 - FvFc H, 4 - FvFc O, 5 – FvFc L, 6 – FvFc A. 7 – Marcador molecular Bench MarkerTM Prestained – Invitrogen®.