CAPÍTULO III APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS
2. Análise do desempenho cognitivo e qualidade de vida em função das
2.2. Qualidade de vida geral e facetas específicas
Comme décrit dans l’introduction, des données structurales concernant le VDAC ont été obtenues par spectroscopie infrarouge et CD et microscopie électronique. La protéine est constituée d’environ 50% de brins bêta formant un tonneau constitué de 16 à 18 brins contenant 9 à 7 résidus (Abrecht et al 2000a). Pour relier la structure à la fonction il faut identifier les résidus présents dans le pore et participant à l’activité canal. Les VDAC de plantes, animaux et champignons ont la même activité canal et toutes les données structurales disponibles suggèrent que leur structure est conservée. Dès lors, le modèle structural devrait être compatible avec les séquences des différents organismes.
2. Prédictions
Un grand nombre de méthodes de prédictions structurales sont disponibles sur le réseau. Les plus anciennes se basaient uniquement sur la présence de motifs liés aux propriétés des résidus (comme l’hydrophobicité) pour détecter les segments correspondant à des structures particulières. Pour la détection de brins bêta transmembranaires, des méthodes de calcul qui tiennent compte des propriétés des résidus et de leurs voisinage permettent de mettre en évidence l’alternance caractéristique hydrophile/hydrophobe liée à la structure en feuillet. Différents modes de calcul effectués sur des fenêtres de résidus ont été utilisés. Song et Colombini (1996) calculent la somme des valeurs d’hydrophobicité des résidus impairs à laquelle on soustrait la somme des valeurs d’hydrophobicité des résidus pairs. (Figure IV-1) La valeur absolue de ces sommes est présentée en fonction de la position dans la séquence. Dans la Figure IV-2, les brins bêta sont détectés en calculant la somme des valeurs d’hydrophobicité des n-2, n, et n+2ièmes résidus et des valeurs des n-4 et n+4ièmes résidus pondérées par un facteur ½ (De Pinto et al 1991b). Comme on retrouve une alternance de résidus dans un brin, cette méthode de calcul produira une alternance de valeurs très élevées et très faibles qui permettront de détecter les brins.
A l’aide de ces méthodes des modèles à 12, 13 ou 16 brins ont été construits pour le VDAC. La difficulté de prédiction des éléments de structure secondaire sur base de ces méthodes réside dans la détermination d’un seuil à partir duquel la prédiction d’un brin est jugée acceptable. Interviennent également dans ce choix le nombre de résidus nécessaires pour avoir un brin bêta transmembranaire. Les Figures IV-1 et IV-2 ont mené à la construction des modèles à 12 et 16 brins respectivement. Différents pics non retenus par ces auteurs mais présentant un caractère bêta ont été entourés. La règle qui a permis de les rejeter n’est pas explicite. La Figure IV-1 montre que le profil d’hydropathie est semblable pour les VDAC de différents organismes.
PHD
(2001) 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 0 50 100 150 200 250 300 Residue # P robability H 1 2 3 H 4 5 H 6 7 8 9PHD
(2001) 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 0 50 100 150 200 250 300 Residue # P robability H 1 2 3 H 4 5 H 6 7 8 9 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 50 100 150 200 250 300 Residue #Probability for assigning structure
H I II III IV V VI VII VIII IX X ( ) XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII
Prof
0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 50 100 150 200 250 300 Residue #Probability for assigning structure
H I II III IV V VI VII VIII IX X ( ) XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII
Prof
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101 106 111 116 121 126 131 136 141 146 151 156 161 166 171 176 181 186 191 196 201 206 211 216 221 226 231 236 241 246 251 256 261 266 271 276 281 286 291Yeast H Yeast B Yeast T Neurospora H Neurospora B Neurospora T Fawaz2 H Fawaz2 B Fawaz2 T
Figure IV-3: Prédictions obtenues par l’algorithme PHD. Les hélices sont indiquées en rouge, les brins bêta en jaune et les tournants en bleu.
Figure IV-4: Prédictions obtenues à l’aide de l’algorithme Prof. Les brins prédits avec une probabilité supérieure à 0.7 sont indiqués par un chiffre romain.
Figure IV-5: Superposition des prédictions structurales de levure, Neurosporaet riz obtenues à l’aide de l’algorithme programme SECPRED
Actuellement, une série d’algorithmes permet de prédire la probabilité pour chaque résidu de faire partie d’un type de structure secondaire en utilisant une base de données comprenant des protéines dont la structure est connue (PHD, Prof,…). Un algorithme permet de détecter de manière spécifique des segments bêta transmembranaires (betabarrelHMM at CIRB – University of Bologna).
2.1. Prédictions de la structure secondaire
Il est bien établi que le VDAC est constitué d’un feuillet bêta. Une probabilité de se trouver dans une structure secondaire peut être calculée pour chaque résidu à l’aide d’une comparaison à une banque de données de protéines cristallisées. Dans le cas du VDAC chaque brin transmembranaire doit être constitué d’une suite de 6 à 10 résidus. La prédiction structurale nécessite la définition d’un seuil de probabilité au dessous duquel on ne peut pas donner assez de confiance à la structure prédite.
Le plus couramment, les banques de données utilisées contiennent toutes les protéines cristallisées. Parfois un échantillon reprenant une classe structurale permet d’affiner la prédiction. Pour le VDAC, le choix de la base de données est critique. Le canal est une protéine membranaire en tonneau bêta. Il existe à l’heure actuelle une dizaine de tonneaux bêta membranaires cristallisés, tous d’origine bactérienne. Ils constituent une infime minorité des structures disponibles. Les protéines membranaires quelles qu’elles soient sont déjà fortement sous-représentées dans les bases de données. Au cours de ce travail, trois algorithmes utilisant trois banques de données ont été utilisés. Le premier (PHD) a permis de prédire une structure comprenant 20% d’hélice a et 30% de brins ß. Pour chaque acide aminé, la probabilité de le trouver dans une hélice a, un brin ß ou un tournant est calculée. La valeur la plus élevée est reportée en graphique avec tournants en bleu, les hélices en rouge et les brins ß en jaune. (Figure IV-3) Il faut noter que vu le nombre de résidus hydrophiles, le VDAC a été prédit comme étant une protéine soluble, et non pas comme une protéine membranaire. Cet algorithme se base sur une large banque de protéines cristallisées et est dès lors plus adapté à la prédiction de protéines solubles. La prédiction présente plus d’hélice alpha et moins de brins bêta que ce qui a été déterminé expérimentalement pour le VDAC et ne constitue de ce fait pas un modèle acceptable. Le deuxième programme (Prof) utilise une base de donnée et un algorithme permettant de prédire avec beaucoup de précision les résidus en brins bêta. Il prédit 19 brins et une courte hélice amino-terminale. (Figure IV-4)
Un algorithme semblable (SECPRED) également optimisé pour la détection de feuillet bêta donne les mêmes résultats. Dans le cas du VDAC, les prédictions obtenues pour différents VDAC sont tout à fait superposables. La Figure IV-5 présente les prédictions pour le VDAC de riz, de levure et de
Neurospora.
Pour comparer les algorithmes et éventuellement éliminer les brins mal prédits, un tableau synthétique est présenté (Table IV-1). Pour 12 VDAC de différents organismes (levure, neurospora, homme, pois, arabidopsis et riz) le premier résidu prédit dans chaque brin se trouve dans la première colonne.
1QJP OMPA E 1 4 11 7 12 7 E 2 1 2 17 16 18 1 5 17 E 3 3 3 39 36 45 3 6 45 E 4 4 0 46 E 5 4 8 53 50 53 4 7 5 1 5 3 54 5 7 5 9 E 6 5 4 61 6 7 68 E 7 7 3 79 71 7 2 8 1 85 7 1 73 E 8 8 0 87 7 7 8 2 8 6 87 E 9 9 0 96 91 96 9 1 95 H1 E10 9 7 109 99 101 102 107 100 101 104 E11 111 121 E12 122 127 121 125 120 125 E13 128 132 127 131 127 128 131 132 E14 134 139 136 139 139 143 134 139 H2 E15 140 144 141 146 H3 E16 162 171 161 162 168 169 161 162 169 170 PHI-WWW PHD
Table IV-2: Comparaison des méthodes de prédictions (prédiction de brins transmembranaires, programme Prof, méthodes de calcul de Colombini et De Pinto)
Table IV-3: Comparaison des algorithmes Prof et PHD
TM (01) 15 - 23 TM (01) 17 - 24 Helix 8 20 Helix 5 23 Helix 2 22 TM (02) 25 - 31 TM (02) 26 - 31 TM (01) 26 33 TM (01) 27 36 TM (01) 24 33 TM (03) 39 - 44 TM (03) 39 - 44 TM (02) 38 43 TM (02) 38 47 TM (02) 40 50 TM (04) 54 - 62 TM (04) 54 - 61 TM (03) 50 59 TM (03) 53 61 TM (05) 64 - 70 TM (05) 63 - 70 TM (04) 62 70 TM (03) 65 74 TM (04) 66 72 TM (05) 77 83 TM (05) 80 88 TM (06) 89 - 96 TM (06) 89 - 96 TM (06) 90 96 TM (04) 91 99 TM (06) 94 103 TM (07) 103 - 110 TM (07) 103 - 110 TM (07) 104 111 TM (05) 103 112 TM (08) 113 121 TM (06) 117 124 TM (07) 126 135 TM (08) 131 - 139 TM (08) 131 - 138 TM (09) 127 134 TM (08) 138 147 TM (09) 141 - 146 TM (09) 140 - 146 TM (10) 140 147 TM (07) 141 150 TM (10) 151 - 158 TM (10) 151 - 158 TM (10') 154 161 TM (11) 160 - 166 TM (11) 160 - 166 TM (12) 168 - 173 TM (12) 168 - 173 TM (11) 168 175 TM (08) 167 176 TM (09) 177 183 TM (13) 181 - 189 TM (13) 181 - 188 TM (12) 180 188 TM (10) 188 198 TM (14) 195 - 203 TM (14) 193 - 198 TM (13) 196 204 TM (11) 202 213 TM (15) 200 - 205 TM (15) 210 - 218 TM (16) 211 - 218 TM (14) 211 219 TM (12) 218 228 TM (17) 229 - 236 TM (15) 225 230 TM (09) 224 233 TM (13) 231 238 TM (16) 235 - 243 TM (18) 238 - 243 TM (16) 235 244 TM (10) 235 244 TM (14) 241 249 TM (17) 248 - 255 TM (19) 248 - 255 TM (17) 248 256 TM (11) 253 259 TM (15) 258 266 TM (18) 265 - 272 TM (20) 265 - 272 TM (18) 266 274 TM (12) 268 276 TM (16) 274 283 Colombini De Pinto Prof
HMM - Beta strand predictors 6-9 résidus 6-8 résidus
Table IV-1: Prédiction des brins bêta à l’aide du programme SECPRED. Les positions des résidus ont été corrigées en fonction de l’alignement des séquences. Le premier résidu prédit dans chaque brin se trouve dans la première colonne. Les premiers et derniers résidus prédits avec une probabilité supérieure à 0.7 se trouvent dans les deuxièmes et troisièmes colonnes et la dernière contient le dernier résidu prédit dans le brin en question.
POR1 HUMAN POR2 HUMAN POR3 HUMAN ABD ABD Hsr2 PEA
H1 11 18 12 19 12 19 13 19 13 19 13 19 E1 25 32 33 26 34 35 26 27 34 27 34 35 27 34 35 27 28 34 35 E2 37 38 43 44 38 39 44 46 38 39 44 45 39 44 45 39 44 45 39 44 45 E3 50 51 62 63 51 52 64 51 52 63 64 53 63 53 63 52 53 62 63 E3' E4 68 69 74 75 69 70 75 76 69 70 75 76 67 68 73 76 67 68 73 76 68 73 74 E5 80 81 86 87 81 82 87 88 81 87 81 84 86 81 83 84 86 80 81 86 87 E6 95 96 101 102 96 97 102 103 96 97 102 103 94 95 98 100 94 95 98 100 94 98 99 E7 112 117 118 111 115 120 113 117 119 111 115 116 111 115 116 111 116 117 E8 123 126 130 131 121 122 132 133 123 125 129 132 122 124 127 122 124 127 123 124 128 E9 137 141 142 144 137 138 144 145 138 139 144 145 134 135 140 141 134 135 140 141 134 135 140 141 E10 147 149 156 158 149 150 154 159 148 150 157 158 145 146 154 155 145 146 154 155 146 147 154 155 E11 165 167 171 172 165 169 171 172 165 167 171 172 163 164 169 170 163 164 169 170 162 167 168 170 E12 177 183 178 183 184 178 184 175 181 175 181 175 181 E13 189 192 196 197 192 193 197 198 189 193 197 198 187 191 195 196 187 191 195 196 188 194 195 E14 202 204 210 211 203 205 211 203 205 210 211 200 201 209 210 200 201 209 210 202 211 E15 217 225 218 226 217 218 226 215 216 220 224 215 216 220 224 217 218 222 225 E16 230 231 236 237 231 232 237 231 232 237 230 231 236 230 231 236 232 233 238 E17 241 242 248 249 241 242 249 251 242 249 250 241 242 248 249 241 242 248 249 243 244 250 251 E18 255 261 262 255 256 262 263 256 262 263 254 255 261 262 254 255 261 262 257 263 264 E19 273 274 280 274 275 282 283 274 277 281 272 275 279 272 275 279 274 276 281 H2 290 295 E20 299 300 304
Neurospora POR1 Yeast POR2 Yeast VDAC1 VDAC2 -6 VDAC3 H1 11 17 12 17 11 15 13 18 13 14 15 19 11 14 17 E1 26 33 34 26 27 34 26 27 32 33 26 27 33 26 33 25 32 E2 39 44 45 39 44 45 38 43 44 38 43 44 37 38 43 36 37 41 42 E3 51 52 62 63 53 54 62 63 52 53 52 61 62 51 52 61 51 52 61 +2 E3' 57 58 62 63 E4 68 74 67 68 74 75 70 75 76 67 72 73 66 67 72 73 66 71 72 E5 80 81 86 91 81 82 87 88 82 87 88 81 82 83 84 79 80 85 79 84 85 +3 E6 93 95 101 103 95 96 101 102 96 98 100 101 93 94 97 98 94 95 98 99 93 94 97 99 E7 111 112 116 117 111 116 117 110 111 115 116 110 115 116 111 112 115 116 110 111 115 116 +6 E8 122 124 127 128 122 125 130 122 123 127 128 121 123 126 127 122 124 127 128 121 123 126 127 E9 135 136 141 142 135 136 142 144 135 141 142 133 134 140 141 134 135 140 141 134 135 139 140 E10 147 148 153 156 147 148 152 156 145 147 150 155 144 145 153 154 145 146 154 155 144 145 153 154 E11 164 166 169 171 164 168 171 162 164 169 170 162 166 167 169 162 163 167 170 161 163 167 169 E12 176 182 176 181 182 175 181 174 180 175 181 174 180 E13 189 190 196 197 190 191 194 195 188 190 193 194 187 189 194 195 188 190 195 187 189 194 195 E14 202 204 209 211 201 204 209 211 200 204 208 209 201 202 209 210 200 209 210 201 202 209 210 E15 217 218 225 226 217 218 225 226 216 223 224 215 216 223 224 215 216 220 224 216 217 224 225 E16 231 232 237 238 231 232 237 229 230 235 236 230 231 236 237 230 231 236 231 232 237 +7 E17 242 243 249 250 242 243 249 250 240 241 246 248 241 242 248 249 241 242 248 249 242 249 250 E18 255 256 262 263 255 256 262 263 253 254 260 261 254 255 261 262 255 261 262 256 262 263 E19 274 278 281 274 275 281 272 275 278 279 272 274 279 272 274 279 273 275 280
Les premiers et derniers résidus prédits avec une probabilité supérieure à 0.7 se trouvent dans les deuxièmes et troisièmes colonnes et la dernière contient le dernier résidu prédit dans le brin en question. On voit que 18 brins comprennent au moins 6 résidus bien prédits et ce dans toutes les séquences analysées. Il faut noter qu’il y a des décalages liés aux différentes longueurs des protéines. Les positions des résidus ont été corrigées en fonction de l’alignement des séquences de façon à permettre la comparaison entre les séquences. Les différences entre les séquences de plantes et d’animaux sont indiqués dans les carrés colorés figurant à gauche de la Table.
2.2. Prédictions de segments par Neural Network
Un algorithme uniquement utilisé pour détecter des brins bêta transmembranaires a été développé à Bologne. Il utilise une base de données exclusivement constituée de tonneaux bêta transmembranaires. Le nombre de résidus attendus pour chaque segment doit être déterminé à priori. La définition de segments contenant 6 à 8 ou 6 à 9 résidus a permis de détecter 18 ou 20 brins respectivement dans différentes séquences de VDAC. Les résultats se trouvent dans les deux premières colonnes du tableau de comparaison entre algorithmes qui sera discuté ci-dessous (Table IV-2).
2.3. Comparaisons des différents modèles
La comparaison des différentes méthodes montre que l’algorithme PHD prédit systématiquement trop d’hélices pour les protéines en feuillet bêta. L’exemple de la protéine bactérienne en tonneau bêta OmpA indique que PHD donne de moins bons résultats que Prof en ce qui concerne la proportion de structure secondaire (Table IV-3). Par contre deux segments (E6 et E11) ne sont pas prédits par Prof. La comparaison des deux algorithmes donne des résultats similaires pour les autres protéines en tonneau bêta dont la structure a été déterminée au niveau atomique.
Les méthodes de prédiction optimisées pour la détection de brins bêta peuvent être comparées (Table IV-2). La méthode de détection de segments par Neural Network prédit 18 ou 20 segments. Les segments 14 et 15 du modèle à 6-8 résidus correspondent au segment 14 ddu modèle à 6-9 résidus (cadres bleus dans la Table 2). Les deux segments du modèle à 6-8 résidus sont très courts (6 résidus seulement) et seulement séparés par 1 résidu. Nous estimerons donc que 19 brins sont effectivement définis dans le modèle à 6-8 résidus par brin.
Si les segments prédits par cette méthode sont comparés à ceux prédits par les autres méthodes, on remarque que les segments 10 et 11 ne sont bien prédits par aucun autre algorithme. Le segment 10 apparaît seulement dans les résultats du programme Prof avec une probabilité faible. Par contre la méthode NN ne prédit pas de segment correspondant aux segments 5 et 8 de la prédiction Prof. (lignes jaunes dans la Table 2).
Les modèles qui se basent sur le profil d’hydrophobicité des résidus éliminent des brins qui sont par ailleurs définis dans les autres modèles (lignes grisées Table 2).
I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII
Hordeum Zea Oryza Pennisetum Pennisetum Triticum Triticum Zea Sorgh Oryza Hordeum Triticum Zea Oryza Oryza Hordeum Triticum Zea Oryza Pos Seq. Conservation
70KKLT 11% 224RRLS 26% 14SGIG 32% 42SGVG 51TRK 74% 100STK 21% 106SVK 26% 137TSK 5% 165SGK 26% 201TIK 26% 223TRR 26% 227STK 5% 246TVK 47% 254SGK 26% 286STK 63% 294SLK 11% 58TVGE 5% 72TVVD 26% 80SESD 21% 89TVDE 100% 164SSGD 11% 178TSSD 95% 227SRNE 68% 237TQHE 11% 275TEVD 21% 18KKTRDLLY 63% 108KLPDYNY 5% 11GLYSGI 21% 4 3GVAITA 95% 55GGLYTL 26% 1 2 9GINASV 63% 1 4 6GVFGSK 79% 1 5 6GVDVSF 100% 1 7 4GLTINN 37% 2 1 5GTAAGA 11% 2 1 9GAELSH 63% 2 3 0GNTITF 5% 2 3 6GSQHSL 74% 2 6 5GMASAL 58% 2 9 0GLALSL 58% 2 3 9HSLDPHTSVKARFNNYGMASALV74%
Pattern-DE: Eukaryotic mitochondrial porin signature Pattern-DE: Tyros ine kinase phosphorylation site
Pattern-DE: N-myristoylat ion s ite Pattern-DE: Protein kinase C phosphorylation site
Pattern-DE: Casein kinase II phosphorylation site
Monocot B Monocot C1 Monocot C2 Monocot C3
Pattern-DE: Glycosaminoglycan attachment site
Pattern-DE: cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site
Figure IV-6: Conservation de motifs et de la « signature porine » dans les séquences de VDAC de monocots
Figure IV-7: Projection hélicoïdale de l’extrémité aminoterminale du VDAC32 du haricot
Figure IV-8: Modèle structural. L’hélice n-terminale est représentée par le cylindre rouge et les brins par les flèches jaunes numérotées en chiffres romains.
En conclusion, le modèle proposé par le programme Prof est celui qui offre la prédiction contenant le plus grand nombre de segments et contient tous les segments prédits par les autres algorithmes à l’exception du brin situé entre le 160ième et le 166ième résidu qui est rejeté dans une majorité de modèles. C’est donc le modèle qui sera retenu dans la suite de notre travail.
2.4. Motifs de phosphorylation et « signature porine »
Parallèlement aux prédictions structurales, une recherche de motifs a été effectuée. Les motifs consensus liés à la présence de sites possibles de phosphorylation sont relativement simples et seuls les motifs très conservés pourraient être intéressants. Un exemple pour les VDAC de poacées est présenté dans la Figure IV-6. Un grand nombre de sites de phosphorylations sont détectés dans les différentes protéines (chaque colonne correspond à une protéine). Un site possible de phosphorylation par la caséine kinase II est très conservé (T90XXE) et deux à trois sites de phosphorylation par la protéine kinase C sont bien conservés dans chacun des trois règnes. Parfois les sites sont présents dans certains groupes de séquences seulement (T51RK dans les VDAC C dans notre exemple). Il n’est pas du tout sûr que ces sites soient effectivement phosphorylés étant donné que le seul site de phosphorylation qui a été mis en évidence est une tyrosine en position 22 (Florke et al 1994a).
Il a été suggéré qu’un motif consensus permet d’identifier les protéines VDAC. Il s’agit du motif correspondant à des résidus présents entre le 220ième et le 240ième résidu de la séquence : [YH]-X(2)-D- [SPCAD]-X-[STA]-X(3)-[TAG]-[KR]-[LIVMF]-[DNSTA]-[DNS]-X(4)-[GSTAN]-[LIVMA]-X-[LIVMY] (Prosite PS00558). La Figure IV-6 (dernière ligne) indique que cette « signature porine » ne permet pas de retrouver tous les VDAC et ne représente pas de ce point de vue un bon consensus. Il faut également noter que cette séquence apparaît dans certaines protéines homologues de Tom40 qui possède également une structure en feuillet bêta. Ce motif est donc probablement caractéristique de brins bêta plutôt que spécifique du VDAC.
2.5. Projection hélicoïdale
Une hélice ayant été prédite dans les premiers résidus, un programme permettant de visualiser ces résidus le long d’une hélice a été utilisé (Abrecht 2001a). Il a permis de constater que si une hélice est formée, elle présenterait un caractère amphipathique. (Figure IV-7) Les résidus hydrophobes sont entourés et regroupés sur une face de l’hélice alors que les résidus chargés (R, K, D) se trouvent à l’opposé. Cette hélice amphipatique peut être prédite dans tous les VDAC étudiés.