As amostras utilizadas para o estudo das relações Fo vs. chl a e NDVI vs. chl a foram sujeitas a um procedimento para quantificação da chl a pelo método de Lorenzen (1967), com aplicação das adaptações propostas por Plante-Cuny (1974) referentes ao teor em água do sedimento. A extracção ocorreu em solução aquosa de acetona a 90%, durante 24h, com manutenção da amostra no escuro e no frio (4º C). Após este período procedeu-se à quantificação espectrofotométrica da chl a em solução, com a leitura da absorvância das amostras a 750 nm (valor da turbidez) e a 665 nm (pico de absorção chl
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A resposta fototáctica do MPB foi estudada através da exposição de amostras de sedimento a diferentes níveis de irradiância e pela monitorização das alterações induzidas na biomassa produtiva através da medição de Fo e NDVI (Figura 2.8). Os resultados destas experiências foram usados na construção de curvas de fotoacumulação (biomassa vs. irradiância), que resumem a resposta migratória em função da irradiância incidente.
Durante o período coincidente com o início da baixa-mar no local de colheita as amostras foram expostas a 150 µmol m-2 s-1, durante 1h30, de forma a induzir a migração das microalgas móveis para a superfície do sedimento. Após este período as amostras foram distribuídas por sistemas de iluminação, com diferentes níveis de irradiância, durante um intervalo de tempo de 3-4 horas, durante o qual a reflectância espectral e Fo foram registadas a cada 20 min. Cada amostra foi exposta separadamente a um nível de irradiância constante durante este período. Uma das amostras foi transferida para o escuro (0 µmol m-2 s-1) onde foi mantida durante um período equivalente, com a respectiva monitorização de reflectância e Fo, a cada 20 min.
As amostras foram expostas a uma luz actínica branca emitida por uma lâmpada de halogéneo (Volpi Intralux 5000 -1, Volpi, Suiça) e transmitida à amostra por uma fibra óptica acoplada num anel de luz com um diâmetro de 5 cm (Standard Ringlight, Volpi, Suiça) (Figura 2.9). A utilização do anel de luz permitiu a distribuição homogénea da luz no campo sobre a amostra. Cada amostra foi colocada no centro do anel de luz, a uma distância vertical ajustada de acordo com a irradiância incidente desejada. A irradiância incidente na superfície de cada amostra foi monitorizada por um micro-sensor PAR (Spherical MicroQuantum Sensor, US-SQS/W, Walz).
Estudo da Resposta Fototáctica do MPB Estuarino 42 Amostragem Processamento das amostras 7 corers - 7 anéis mantidos em caixas de petri
com água
Baixa-mar do dia seguinte à colheita
Anéis mantidos a irradiância constante
150 µmol m-2 s-1 24 h 1h30 0 100 250 500 1000 1500 Irradiância µmol m-2 s-1 Cada 20 min Reflectância Fluorescência Fo 2 min escuro 3 – 4 h Sistemas de iluminação independentes 50
Figura 2.8. Representação esquemática do protocolo experimental.
Foram utilizados seis sistemas de iluminação independentes para simultaneamente, expor cada uma das 6 amostras de sedimento aos seguintes níveis de irradiância: 50, 100, 250, 500, 1000 e 1500 µmol m-2 s-1. Na execução da experiência,
para medição dos parâmetros, cada amostra foi transportada, a cada 20 minutos, com o mínimo de distúrbio até às fibras ópticas de medição, quer de reflectância quer de fluorescência. Os valores de Fo e NDVI obtidos foram normalizados relativamente aos últimos valores registados no período inicial em que as amostras estiveram, simultaneamente, expostas à mesma luz baixa (150 µmol m-2 s-1) de indução da migração.
Paralelamente à execução das experiências, em alguns dias, foram executadas fotografias ao microscópio óptico da superfície de cada amostra de sedimento.
Figura 2.9. Aspecto do sistema de iluminação utilizado no protocolo experimental.
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Após a realização do procedimento experimental, para construção das curvas de fotoacumulação, foi seccionado 1 mm (superficial) de cada amostra de sedimento de forma a proceder à determinação da composição taxonómica. A amostra de sedimento obtida do 1º mm foi diluída em água filtrada, proveniente do local de amostragem. Os preparados de sedimento diluídos foram fixados em 1% v/v de formaldeído (gluteraldeído). As amostras foram observadas ao microscópio óptico (10x, 40x) em câmara de Sedgewick-Rafter (Electron Microscopy Sciences) (Figura 2.10), a fim de determinar a abundância relativa dos grupos taxonómicos principais (Diatomáceas, Euglenófitas, Cianobactérias) por contagem, até um total de 400 células.
Estudo da Resposta Fototáctica do MPB Estuarino
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Figura 2.10. Câmara de Sedgewick-Rafter usada para a contagem de células.
A identificação de diatomáceas foi realizada em preparações microscópicas definitivas, preparadas por oxidação de sub-amostras do 1º mm de sedimento, utilizando ácido nítrico e dicromato de potássio para eliminar a matéria orgânica. Nas amostras de GE, para acelerar o processo de degradação do sedimento mais grosseiro, foram adicionadas 4 gotas de ácido clorídrico (1 M). As valvas limpas foram montadas em Naphrax (Thornton et al. 2002). As espécies foram identificadas seguindo as descrições de Bourrely (Bourrely 1981), Hartley et al. (Hartley et al. 1996), Krammer e Lange-Bertalot (Krammer e Lange-Bertalot 1986), Krammer e Lange-Bertalot (Krammer e Lange-Bertalot 1988), Peragallo e Peragallo (Peragallo e Peragallo 1897) e Witkowski et al. (Witkowski et
al. 2000).
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A significância das regressões lineares entre a chl a e os parâmetros Fo e NDVI foi testada utilizado o cálculo de probabilidades para correlações do software STATISTICA 6.0. Foi utilizado o mesmo software para a aplicação de análise de covariância (ANCOVA) à relação entre Fo e a concentração de chl a para diferentes níveis de irradiância. Sendo a homogeneidade dos declives um pressuposto da ANCOVA foi realizado um teste-F preliminar utilizado para comparar os declives das regressões lineares. Posteriormente, foi testada a hipótese de haver diferenças significativas na origem (Sokal e Rohlf 1981).
Estudo da Resposta Fototáctica do MPB Estuarino 46 0 100 200 300 400 500 6000.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ! ) * 0 100 200 300 400 500 600 0 100 200 300 400 500 600 , - . ./ 3 3..11..FFoo,,NNDDVVIIvvss..bbiioommaassssaassuuppeerrffiicciiaall
Foram verificadas experimentalmente relações lineares entre o conteúdo em chl a no sedimento e Fo e NDVI, o que permite atribuir as variações de Fo e NDVI a alterações directamente proporcionais na concentração de biomassa à superfície do sedimento (Figura 3.1). Ambos os parâmetros estão positivamente correlacionados com o conteúdo em chl a. Na relação Fo vs. chl a 93.2% da variação de Fo foi explicada pela variação no conteúdo de chl a enquanto que 88.1% da variação de NDVI foi explicada pela variação do conteúdo em chl a.
Biomassa, chl a (µg/g)
Figura 3.1. Regressão linear entre a biomassa superficial (µg chl a /g sedimento seco) e (A) a fluorescência da chl a após adaptação ao escuro (Fo, unidades relativas; r2=0.932, p<0.001, n=15)
e(B) NDVI (r2=0.881, p<0.001, n=13).