Quantificação da corticosterona circulante

A Figura 10 mostra os níveis séricos de corticosterona. Foram encontradas diferenças significantes entre os diferentes grupos (P <0,001). Os níveis séricos de corticosterona foram maiores nos animais dos grupos T e I, isto é, os animais infectados que ingeriram MFT apresentaram aumento nos níveis circulantes de corticosterona em comparação aos animais dos grupos N T/HS35 e I/HS35. Curiosamente, não foram encontradas diferenças significantes nos níveis séricos de corticosterona entre as aves dos grupos N, T/HS35 e I/HS35.

Figura 10 - Níveis séricos de corticosterona

Fonte: (CALEFI et al., 2016)

Legenda: As diferentes letras sobre as barras indicam diferenças significantes com P < 0.05 (ANOVA e Tukey para comparações múltiplas). Grupo Controle (Naive); Grupo alimentado com caldo tioglicolato (T); grupo infectado com Clostridium (I); /HS35 indica o grupo estressado por calor.

6.3.5 Identificação bacteriana

Colônias consistentes com C. perfringens foram isoladas a partir do conteúdo do duodeno, jejuno, íleo de todas as aves infectadas (I e I/HS35). Estas colônias isoladas foram posteriormente confirmadas como sendo do tipo A pelo método de PCR multiplex. Em contraste, o Clostridium perfringens não foi encontrado no conteúdo do intestino das aves que não foram infectadas (N, T e T/HS35).

6.4 DISCUSSÃO

Relatos anteriores estabeleceram uma base bioquímica e molecular sólida para a comunicação bidirecional entre os sistemas neuroendócrinos e imune (BLALOCK; COSTA, 1989; BESEDOVSKY; DEL REY, 1996; BASSO et al., 2003; COSTA-PINTO; PALERMO-NETO, 2010). Sabe-se que os sistemas nervoso, imunológico e endócrino são modulados por uma miríade de receptores de citocinas, neurotransmissores, hormônios e neuropeptídios. Além disso, moléculas anteriormente relatadas como produtos específicos de um desses sistemas, também têm sido encontradas nos outros. Por exemplo, citocinas podem ser sintetizadas no sistema nervoso central, enquanto que os hormônios, tais como ACTH e TSH, podem ser produzidos por células linfoides (BESEDOVSKY; DEL REY, 1991). Estas interações bidirecionais desempenham um papel importante não só na fisiologia destes sistemas, mas também em vários processos fisiopatológicos (ADER; COHEN; FELTEN, 1995). Embora estas relações sejam bem documentadas em mamíferos, alguns raros estudos são encontrados na literatura sobre interações neuroimunes em aves.

No presente estudo, focamos as relações entre o estresse térmico por calor, infecção por C. perfringens e mudanças na atividade do SNC de frangos de corte. Nossos resultados mostraram uma relação direta entre os efeitos do estresse por calor e a infecção pelo C. perfringens sobre a inflamação do intestino, os níveis séricos de corticosterona a expressão de c-fos em áreas do SNC, fatos estes que podem ser compreendidos como relacionados à atividade do eixo HPA.

Mostrou-se que a infecção por C. perfringens foi capaz de alterou o comportamento dos frangos. Na verdade, ele aumentou a frequência de comportamento tipo sonolento e diminuiu a frequência de alimentação, de andar e o de arranque de penas nas aves do grupo I. Embora em menor magnitude, as alterações de comportamento observadas nos animais do grupo I foram também observadas nos animais do grupo T, isto é, naqueles que receberam somente o caldo tioglicolato. O tioglicolato é uma substância irritante que produz inflamação intestinal (NATHAN; ROOT, 1977). Assim, parece possível sugerir que as alterações comportamentais observadas nos animais dos grupos I e T sejam indicativas do comportamento doentio (CD). CD é caracterizado por alterações comportamentais

que são semelhantes às observadas nas aves dos grupos T e I. Estudos anteriores indicaram que o CD pode ser induzido por doenças entéricas, um fato que foi interpretado pelos autores como uma indicação da existência de uma interação do eixo cérebro-intestinal (GRENHAM et al., 2011). Citocinas, tais como IL-1 e IL-6, entre outras, são libertadas a partir do intestino inflamado e podem ser responsáveis pelas alterações comportamentais indicativas do CD atualmente reportadas nas aves nos grupos I e T. A dor visceral induzida por enterite já foi indicada como hipótese da transmissão pelo sistema neuroentérico da informação sensorial visceral, via nervo vago, para o SNC. Este efeito, em conjunto com a libertação de citocinas na mucosa entérica, tem sido relatado como capaz de induzir o CD (DANTZER et al., 2008). O CD em aves é caracterizado principalmente pela presença de aumento de padrões de comportamento tipo sonolento (GREGORY et al., 2009). A este respeito, a inflamação do intestino induzida pelo caldo tioglicolato pode ter liberado mediadores pró-inflamatórias da mucosa do intestino, tais como citocinas, como relatado em outros locais em contextos experimentais diferentes (GAUTIER et al., 2013).

Nossos dados também mostraram que o estresse térmico diminuiu algumas das mudanças comportamentais relatadas e induzidas por inflamação nos frangos. Em particular, a frequência de comportamento tipo sonolento em animais que receberam tioglicolato e foram infectados (grupos T/HS35 e I/HS35). Curiosamente, tal como mostrado na Figura 5, o estresse por calor reduziu a inflamação intestinal, um efeito que está de acordo com o descrito anteriormente por nosso grupo (CALEFI et al., 2014). Em conjunto, os nossos dados sugerem a existência de uma relação interessante entre a intensidade da inflamação no intestino e o comportamento dos frangos doentes.

Como esperado a partir da infecção com o C. perfringens (CALEFI et al., 2014), observamos intensa inflamação, caracterizada pela presença de escores mais altos de necrose e inflamação e um aumento do número de células polimorfonucleares e mononucleares, nas aves do grupo I. Os sinais de inflamação dos frangos do grupo I, no entanto, foram reduzidos pelo estresse térmico por calor (grupo I/HS35), um efeito que é consistente com os dados comportamentais discutidos acima. Parece pertinente afirmar que, no presente estudo, o estresse térmico não foi capaz de alterar os parâmetros inflamatórios aqui relatados nas aves dos grupos que ingeriram o caldo tioglicolato (grupos T e T/HS35), indicando a

importância da infecção bacteriana para os efeitos do estresse térmico por calor sobre a inflamação do intestino. A este respeito, a necrose intestinal induzida pelo tioglicolato por si só, pode ter prejudicado as barreiras físicas nos intestinos, uma condição que é desejável para a infecção por C. perfringens e a produção de toxinas pela bactéria (GRENHAM et al., 2011; CALEFI et al., 2014). As alterações intestinais derivadas do processo infeccioso podem levar a uma ativação de neurônios no SNC. Para determinar tais ativações são empregadas técnicas para avaliação de proteínas que são produzidas durante a ativação cerebral.

Genes precoces imediatos celulares (IEGs) respondem à estimulação transsináptica e a atividade elétrica de membrana em células neurais; a transcrição de IEGs é ativada rapidamente e transitoriamente poucos minutos após a estimulação (GREENBERG; ZIFF; GREENE, 1986). O proto-oncogene c-fos foi um dos primeiros IEGs identificados (BARTEL et al., 1989) como membro representativo desta família. Nossos dados mostraram que o estresse térmico e a inflamação afetaram de forma diferencial a expressão de c-fos no PVN, GP, POM e Amy dos frangos. Como representado na Figura 6, o estresse térmico induziu um grande aumento na expressão de c-fos no PVN, enquanto o C. perfringens aumentou este parâmetro no GP. Este último efeito parece estar causalmente relacionado com a infecção bacteriana porque a expressão de c-fos nos animais do grupo T manteve- se inalterada no GP. Entretanto, nossos resultados também sugerem um efeito para a inflamação do intestino por si só; de fato, a expressão de c-fos nos animais do grupo T foi mais elevada do que a expressão observada nas aves do grupo controle (N), tanto no PVN como na POM. Em contraste, quase não se observaram alterações na expressão de c-fos na Amy entre os diferentes grupos.

Os efeitos de estresse térmico observados sobre a expressão de c-fos nos animais que receberam o caldo tioglicolato (T/HS35) e/ou foram infectados (I/HS35) diferiram de acordo com a região do cérebro estudada. Como pode ser visto na Figura 6, o estresse por calor aumentou os efeitos do tioglicolato e do C. perfringens sobre a expressão de c-fos no PVN, e este efeito foi maior nos animais infectados (grupo I/HS35). Por outro lado, o estresse térmico diminuiu os efeitos induzidos pelo

C. perfringens na expressão de c-fos no GP e na Amy e não teve qualquer efeito no

POM. Um efeito semelhante sobre a expressão de c-fos foi observado para o tioglicolato na POM e na Amy. Assim, o estresse térmico, o C. perfringens e o caldo tioglicolato afetaram a expressão de c-fos nos núcleos cerebrais dos frangos de

forma diferenciada. De qualquer forma, eles apontam claramente para um aumento da atividade neuronal.

A exposição a estressores ativa o eixo HPA e resulta em uma elevação facilmente perceptível nos níveis de corticosterona no plasma (AXELROD; REISINE, 1984). No presente experimento, tanto o tioglicolato como o C. perfringens aumentaram os níveis séricos de corticosterona em relação ao medido nos animais do grupo controle (grupo N; Figura 7). Assim, parece-nos indiscutível que a inflamação do intestino tenha induzido uma resposta ao estresse nos frangos. Este achado concorda com e reforça relatos anteriores sobre a liberação de citocinas pró- inflamatórias em processos inflamatórios ou doenças entéricas. No entanto, a continuidade e a intensidade da ativação do eixo HPA pode levar a um feedback negativo sobre a produção e liberação de corticosterona. Assim, os animais cronicamente e intensamente estressados poderiam apresentar menores níveis de corticosterona quando comparados com os animais do grupo controle (grupo N; Figura 7). Estes efeitos foram observados em relação aos níveis de corticosterona sérico dos animais dos grupos T/HS35 e I/HS35 em relação aos dos grupos I e T, respectivamente (Figura 7). De forma interessante, outros estudos demonstraram que o calor intermitente per se aumenta significativamente os níveis séricos de corticosterona em aves.

Em conclusão, utilizando-se um modelo experimental projetado para explorar as interações entre os sistemas imunológico e nervoso, mostramos claras relações entre inflamação intestinal, padrões de comportamento, níveis séricos de corticosterona e mudanças na atividade do SNC. Nossos dados apontam para a necessidade de futuros estudos que busquem compreender não apenas a relevância das interações cérebro-intestinais na manutenção da homeostase intestinal, mas também sua importância em produção animal.

7 EFEITOS DO ESTRESSE POR CALOR SOBRE A HISTOPATOLOGIA E