QUANTIFICAÇÃO DA GLICÉMIA

Após o período de estabilização recolheram+se amostras de sangue arterial através de punção da manga de silicone, do lado arterial do circuito, com ajuda de uma microseringa de 25 L (YSI Model 1501 Syringepet).

Foi determinada a glicémia arterial com um analisador de glucose (YSI 1500 Sidekick) até serem obtidos três valores estáveis. A média desses três pontos correspondeu ao nível de glicémia arterial basal.

O analisador de glucose YSI 1500 Sidekick é um equipamento desenvolvido para laboratórios de investigação biomédica que permite a quantificação rápida da glicémia pelo método enzimático do glucose oxidase (GOx). Este aparelho é constituído por uma sonda equipada com uma membrana de três camadas que contém o enzima GOx imobilizado na camada do meio, como ilustrado na figura 3.2.

Figura 3.2: Esquematização da sonda do analisador de glucose. A sonda contém uma membrana de três camadas, em que a camada do meio contém o enzima glucose oxidase imobilizado. Figura adaptada de (YSI, 2001).

A extremidade da sonda, coberta pela membrana, está situada numa câmara reaccional. Quando a amostra é injectada na câmara, o substrato é rapidamente oxidado pelo enzima imobilizado, levando à síntese de peróxido de hidrogénio (H2O2) e

de glucono+δ+lactona, de acordo com a reacção (1).

β ββ

βCDCGlucose + O2 GluconoCδδδδClactona + H2O2 (1)

GOx

O H2O2 é, por sua vez, oxidado no eléctrodo de platina produzindo electrões como

descrito na reacção (2).

H2O2 2H++ O2+ 2eC (2)

Quando as velocidades de formação e libertação do H2O2 se tornam constantes,

atinge+se um equilíbrio dinâmico indicado por uma resposta de estado estacionário. Nesta altura o fluxo de electrões produzido é linearmente proporcional à concentração de H2O2e, portanto, proporcional à concentração de glucose.

O eléctrodo de platina é mantido a um potencial anódico sendo capaz de oxidar várias substâncias para além de H2O2. Para evitar que estes agentes redutores

contribuam para a corrente gerada e detectada pelo sensor, a membrana contém uma camada interna que consiste numa película muito fina de acetato de celulose. Esta película permite a passagem de H2O2 mas exclui compostos químicos com massa

molecular superior a 200 Da. A película de acetato de celulose também protege a superfície de platina de proteínas, detergentes e outras substâncias que a possam danificar.

3.5. O RIST (Teste Rápido de Sensibilidade à Insulina)

A metodologia escolhida para avaliar a sensibilidade à insulina foi o teste rápido de sensibilidade à insulina ou RIST.

Este teste é um euglicémico modificado que apresenta várias características vantajosas em termos de desenho experimental. Destaca+se o facto de o RIST ser um teste de curta duração (cerca de 35 min), podendo ser realizados até 4 testes no mesmo animal, com elevada reprodutibilidade (Lautt , 1998a). O RIST permite assim avaliar a sensibilidade à insulina antes e após cada tratamento farmacológico, no mesmo animal, possibilitando um desenho experimental emparelhado. Para além disso, por ser um teste euglicémico não provoca alterações nos níveis de hormonas contra+reguladoras tais como glucagina, somatostatina e catecolaminas, permitindo uma avaliação exclusiva da acção da insulina (Xie , 1995a). Uma outra vantagem, já referida anteriormente, diz respeito ao facto de o RIST poder ser realizado em animais anestesiados sendo os

resultados independentes da anestesia com pentobarbital sódico (Latour , 2002). As vantagens do RIST comparativamente a outros métodos de avaliação da sensibilidade à insulina serão abordadas mais detalhadamente no capítulo 8 (Discussão Geral).

O RIST iniciou+se com a perfusão de um bólus de insulina 50 mU/kg/min durante 5 minutos (velocidade de perfusão de 6 ml/h, correspondendo a um volume de 0.5 ml perfundido durante 5 min) após a determinação do nível basal de glicémia. Ao primeiro minuto após o início da perfusão de insulina, efectuou+se a primeira colheita de sangue arterial para determinação da glicémia. Simultaneamente iniciou+se a perfusão da solução de glucose 100 mg/ml, a uma velocidade correspondente a 5 mg glucose/kg/min.

Com base nas concentrações de glucose arterial medidas em intervalos de 2 minutos, a velocidade de perfusão de glucose foi ajustada de forma a manter a euglicémia relativamente ao valor basal determinado antes do início do RIST. O RIST deu+se por concluído quando os níveis de glucose arterial retomaram o valor inicial, sem que fosse necessário continuar a perfundir glucose (Lautt , 1998a).

A quantidade total de glucose perfundida (mg/kg) durante o período de duração do teste foi designada por RIST Index e corresponde à área sob a curva traçada pela perfusão variável de glucose (Lautt , 1998a). O RIST Index foi o parâmetro utilizado para avaliar a sensibilidade à insulina e pode ser representado tanto como perfil dinâmico como sob a forma de gráfico de barras. Na figura 3.3 apresenta+se um perfil típico de um RIST.

Figura 3.3: Perfil típico de um RIST ao longo do tempo. Foi estabelecida a linha basal de euglicémia através de leitura de amostras de sangue arterial com intervalos de 5 min. De seguida foi perfundida insulina 50 mU/kg, durante 5 min, por via intravenosa. Ao minuto 1 iniciou+se a perfusão de glucose (5 mg/kg/min) e recolheu+se a primeira amostra de sangue arterial para determinação da glicémia. Com base nas concentrações arteriais de glucose medidas de 2 em 2 min ajustou+se a perfusão de glucose para manter a euglicémia. A quantidade total de glucose perfundida ao longo do teste (mg glucose/kg) corresponde à área sob a curva representada e foi designada por RIST Index. O RIST Index é o parâmetro utilizado para avaliar a sensibilidade à

insulina. Figura adaptada de (Lautt , 1998a).

Após a conclusão do teste foi administrado um suplemento de fluidos de 0,5 ml de soro fisiológico e heparina. Monitorizou+se a PAM e seguiu+se um período de reestabilização do animal, de cerca de 30 min.