Quantificação de Estigmastadienos

A quantificação de estigmastadienos foi realizada segundo a metodologia descrita no Anexo XVII do Diário Oficial de la Unión Europea (2003), equivalente ao método Cd 26-96 da AOCS (2004).

A quantificação de estigmastadienos foi realizada a partir da obtenção da matéria insaponificável do azeite de oliva e subseqüente separação da fração de hidrocarbonetos esteróides por cromatografia em coluna aberta. O resíduo seco obtido foi mantido em pequena quantidade de hexano e posteriormente submetido à análise por cromatografia em fase gasosa. A metodologia é descrita em detalhes, pois a fonte utilizada é de difícil acesso, além de que este é o objetivo principal deste trabalho.

a) Obtenção da Matéria Insaponificável

A matéria insaponificável foi obtida da seguinte maneira:

- Pesou-se 20 g ± 100 mg da amostra homogeneizada em um balão de fundo redondo de 250 mL;

- Adicionou-se 1 mL de solução de colesta-3,5-dieno na concentração de 20 mg/ kg (PI) e 75 mL de solução alcoólica de hidróxido de potássio a 10 %;

- A saponificação aconteceu sob refluxo à temperatura de ebulição, com aquecimento durante 1 hora após o início da condensação;

- Resfriou-se o sistema adicionando, pelo condensador, 100 mL de água destilada fria;

A Figura 3 ilustra a saponificação do azeite de oliva.

- Após resfriamento à temperatura ambiente, o conteúdo do balão foi transferido para um funil de decantação de 500 mL, e o balão foi lavado com o auxílio de 100 mL de hexano (PE 65-70ºC);

- A extração da matéria insaponificável procedeu-se mediante a agitação vigorosa da mistura durante 30 segundos (para permitir a formação do sabão e a separação da matéria insaponificável);

- Após a separação da fase orgânica (superior) da fase aquosa (inferior), recolheu-se a fração de hexano em outro funil de separação;

- Deixou-se em repouso até que se completasse a decantação (se houvesse produção de emulsão que persistisse a desaparecer, adicionava-se pequenas quantidades de etanol);

- Transferiu-se a fase aquosa (inferior) para um segundo funil de decantação e extraiu-se novamente com mais 100 mL de hexano;

- Escoou-se novamente a fase aquosa (inferior) e lavou-se (combinando com outro funil de separação) com três porções de 100 mL de cada vez da mistura água/etanol 96 v/v (1:1) até que se obtivesse pH neutro;

- Filtrou-se a solução lavada através de um funil contendo 50 g de sulfato de sódio anidro e, em seguida, lavou-se o papel com 20 mL de hexano;

- Evaporou-se o solvente em rotaevaporador a 30°C sob pressão reduzida até o volume de aproximadamente 5 mL;

- Transferiu-se o resíduo para um balão tipo pêra, previamente seco e tarado; - Evaporou-se completamente o solvente e secou-se em estufa a 80ºC por 30 min;

- Após resfriamento à temperatura ambiente em dessecador, pesou-se o balão para a determinação do teor de matéria insaponificável da amostra, por gravimetria.

A Figura 4 mostra a matéria insaponificável obtida após a extração com hexano e secagem sob pressão reduzida.

Figura 4. Matéria insaponificável após secagem da amostra.

b) Separação da Fração de Hidrocarbonetos Esteróides

A separação da fração esterólica procedeu-se da seguinte maneira: - Utilizou-se uma coluna de fracionamento composta de vidro e provida de torneira de teflon e anel de vidro em seu fundo, com 1,5 cm de diâmetro interno e 50 cm de comprimento;

- Para o preparo da coluna de sílica gel, utilizaram-se 15 g de sílica e 40 mL de hexano. Após a sedimentação desta solução, acrescentou-se 3 g de sulfato de sódio anidro até uma altura de 0,5 cm da coluna acima descrita;

- Introduziu-se o resíduo resultante da evaporação (item a) na coluna de fracionamento com ajuda de duas porções de 1 mL cada de hexano e iniciou-se a eluição cromatográfica com hexano a um fluxo aproximado de 1mL/min;

- Descartou-se os 20 mL iniciais do eluído (fração 1 – hidrocarbonetos saturados) e recolheu-se os 60 mL seguintes (fração 2 – hidrocarbonetos esteróides) em uma proveta;

A Figura 5 apresenta a ilustração de eluição de matéria insaponificável em coluna aberta.

- Evaporou-se a fração 2 em rotaevaporador a 30°C sob pressão reduzida até a secagem completa da amostra;

- Dissolveu-se imediatamente este resíduo seco em 0,5 mL de hexano grau HPLC e analisou-se a fração por cromatografia em fase gasosa.

c) Cromatografia em Fase Gasosa

Utilizou-se o cromatógrafo gasoso, marca CGC Agilent 6850 Series GC System com detector de ionização de chama (FID) e coluna capilar HP-5 Agilent (5% difenil 95% dimetil polisiloxano), nas dimensões: 60 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 µm de espessura filme. O fluxo da coluna foi de 1,0 mL/ min., a velocidade linear de 24 cm/ seg, o gás de arraste foi o hélio, o volume de injeção de 1,0 µL e split 1:15. A temperatura do detector foi programada a 320ºC, do injetor a 300ºC e o forno foi regulado a 235ºC por 6 min, 235-285ºC (2ºC/ min) e 285ºC por 14 min, totalizando 45 minutos de corrida.

d) Identificação de Picos no Cromatograma

De acordo com a Resolução da Unión Europea (2003), o pico do padrão interno (colesta-3,5-dieno) elui em um tempo de retenção de aproximadamente 19 minutos e o pico do estigmasta-3,5-dieno elui com um tempo de retenção de aproximadamente 1,29 minuto após o pico do padrão.

Os picos do estigmastadieno no cromatograma podem vir acompanhados de pequenas quantidades de um isômero que, em geral, originam um só pico cromatográfico. Se a coluna do cromatógrafo for demasiadamente polar, tem-se um grande poder de resolução, e o isômero pode aparecer em forma de um pequeno pico pouco antes do pico do estigmasta-3,5-dieno. Em outros casos, é necessário somar as áreas dos dois picos. Para se realizar uma técnica

segura, foi necessária a utilização de uma coluna de baixa polaridade e de maior diâmetro interno.

e) Análise Quantitativa

O conteúdo de estigmastadieno foi determinado aplicando-se a fórmula: mg / kg de estigmastadienos = ( As × Mc)

(Ac × Mo)

onde: As ⇒ área de pico de estigmastadieno (se houver pico duplo deve-se somar suas áreas);

Ac ⇒ área de pico do padrão interno (colestadieno); Mc ⇒ peso do padrão adicionado, em microgramas;

Mo ⇒ peso da amostra analisada, em gramas.

A Tabela 18 apresenta os limites máximos permitidos por Legislação para a análise de estigmastadieno.

Tabela 18. Limites máximos permitidos para a análise de estigmastadieno

AZEITE ESTIGMASTADIENO (mG/kG)

Oliva extra virgem ≤ 0,15

Oliva virgem ≤ 0,15

Oliva (virgem+refinado) ___

Oliva refinado ___

Bagaço de Oliva Refinado ___ FONTE: UNIÓN EUROPEA (2003).