Quantificação do DNA

A amostra de DNA dentário foi quantificada por meio kit Quantifiler® Human DNA Quantification (Applied Biosystems) em sistema de PCR 7500 em tempo real

(Applied Biosystens) de acordo com as recomendações do fabricante. As reações foram preparadas em um volume total de 25 µl, contendo 2 µl de DNA da amostra, 10,5 µl de primer mix do kit quantifiler human e 12.5 µl do mix de PCR do kit quantifiler

human. A curva padrão foi produzida a partir séries de diluição com DNA padrão de

0,1 ng/µl a 50 ng/µl corrida em duplicata. Para cada reação havia um controle interno (IPC). Controles negativos foram realizados com água ultrapura. Os dados foram analisados através do ABI Prism® 7500 (SDS software v1.2.3). O baseline foi ajustado automaticamente

As quantificações de DNA foram realizadas em momentos diferentes. As amostras de DNA do tempo T2 e T3 foram analisadas logo após a coleta, pulverização e

extração do DNA dos mesmos. Os dentes do grupo T0 foram quantificados 30 dias após a cirurgia oral e ocorreram na mesma placa do tempo T3. Os dentes dos tempos T1 e T2 foram analisados na mesma placa, sendo que amostras de DNA extraído de T1 permaneceram armazenadas a – 20o C por 5 meses antes da quantificação.

As quantificações ocorreram dentro dos parâmetros de confiabilidade designado pelo fabricante tendo como referência os valores da correlação entre as reações (R2) maior a 0,98 e slope acima de 2,9. Os valores de Ct entre 23 e 32 indicam ausência de inibidores da PCR conforme especificações do fabricante.

5. Amplificação dos STRs

Foram utilizados 17 loci de marcadores STRs autossômicos de diferentes tamanhos de comprimento (Quadro 6).

Quadro 6. Lista de STRs e respectivos tamanhos de comprimento.

STRs Grande STRs Médio STRs Pequeno

Penta E (368 – 482 pb) D16S539 (258 – 310 pb) amelogenina (100 – 114 pb) FGA (305 – 466 pb) TPOX (255 – 295 pb) D3S1358 (105 – 149 pb) D7S820 (305 – 466 pb) SE33 (215 – 350 pb) D5S818 (108 – 157 pb) D18S51 (261 – 360 pb) D12S391 (206 – 255 pb) D19S433 (115 – 170 pb) CSF1PO (316 – 362 pb) TH01 (175 – 204 pb) vWA (118 – 176 pb) D13S317 (163 – 199 pb) D2S1338 (160 – 212 pb)

A qualidade do DNA extraído foi avaliado através da amplificação de STRs, considerando a eficiência global dos marcadores e, também, a eficiência individual de amplificação dos três maiores marcadores (CSF1PO, FGA e Penta E) e dos três menores marcadores (D5S818, D19S433 e D3S1358). Também foram avaliadas como parâmetro de qualidade as áreas dos picos da amelogenina e CSF1PO, tendo em vista representarem, respectivamente, marcadores de tamanhos pequeno e grande.

A caracterização dos alelos foi através do programa GeneMapper® ID v3.2 (Applied Biosystems). A reação da PCR foi processada com 25 µl de mix e 2 µl da amostra em um termociclador ABI GeneAm 9700 conforme instruções do fabricante. Após a amplificação, 1,5 µl da amostra foi separada por eletroforese capilar usando um analisador genético 310 ABI Prism (Applied Biosystems) e os dados foram analisados no software GeneMapper v 3.2 (Applied Biosystems) com limite mínimo de 50 unidades relativas de fluorescência (RFU) para detecção. As áreas dos picos dos alelos foram mensuradas pelo GeneMapper v 3.2. Alelos heterozigóticos foram calculados pela média entre os dois para equlibrar as áreas entre os picos.

6. Análise Estatísitca

Os dados registrados foram tabulados em uma planilha de dados (Microsoft® Office Excel®, 2007) e analisados pelo programa SPSS 20.0 (SPSS Inc, Rainbow Technologies, Chicago, III). Inicialmente foi realizada a estatística descritiva dos dados das variáveis temperatura do ar, precipitação pluvia, umidade do ar, radiação solar e do DNA. Os dados do DNA foram analisados a fim de identificar a presença de diferenças significativas. A análise de variância (ANOVA) one-way foi aplicada para verificar se havia diferenças significativas da variação das médias de quantidade e qualidade do DNA dentro do grupo em tempos diferentes de exposição e entre grupos no mesmo tempo de exposição. Para identificar entre quais grupos as diferenças foram significativas foi aplicado o pós-teste de Tukey. O intervalo de confiança (IC) definido foi de 95% e o nível de significância p ≤ 0,05.

V. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A amostra arrolada na presente pesquisa foi constituída por 65 dentes molares, sendo 40% (n = 26) de indivíduos do sexo masculino e 60% (n = 39) do sexo feminino. A média de idade foi de 24 anos (dp ± 3), a mínina de 18 anos e a máxima de 30 anos. Informações sobre ancestralidade foram ignoradas por não acrescentar dados aos objetivos desta pesquisa.

A constituição da amostra não seguiu critérios demográficos para o sexo e idade, portanto, não foram intencionalmente selecionadas para representar o perfil das vítimas de homicídios no Brasil, tampouco, de estatísticas internacionais. No Brasil, o maior risco de morte por homicídio ocorre entre homens (aproximadamente dez vezes superior ao de mulheres), adolescentes e adultos jovens (15 ı–ı 29 anos; 96/100.00 hab.), negros e residentes em grandes centros urbanos (BRASIL, 2007).

Para efeito de investigações genéticas, as variáveis demográficas (sexo, idade e ancestralidade) não estão relacionadas com a quantidade e qualidade de DNA presente em amostras biológicas. Entretanto, diferenças podem existir entre amostras de dentes frescos de jovens e de idosos, com o tipo e tamanho do dente, condições patológicas, tratamentos dentários e volume da polpa dentária (GAYTMENN; SWEET, 2003, SCHNEIDER et al., 2004). Para minimizar o efeito de eventuais viéses quanto às diferenças de tamanho, tipo e estado do dente, foram analisados unicamente dentes molares, hígidos e de adultos jovens.

Não existem, no Brasil, estatísticas nacionais que demonstram a resolutividade dos métodos de identificação humana de cadáveres não identificados em Institutos de Medicina e Odontologia Legal (IMOL). Em pesquisa realizada por Lessa (2009) em serviços de Medicina Legal de seis regiões metropolitanas brasileiras (São Paulo/SP, Porto Alegre/RS, Salvador/BA, Belém/PA, Goiânia/GO e Rio de Janeiro/RJ), revelou um número de 7.287 (5,4%) cadáveres não identificados dentre um número total de casos de 134.660 mortes de causas externas. No entanto, ao considerar apenas seis regiões metropolitanas das 56 regiões no país, para além de outras cidades, as limitações dos serviços de identificação dos IMOLs e a subenumeração de casos, o número de cadáveres não identificados no Brasil decerto é muito maior. A negligência do Estado na implementação de métodos de identificação mais eficientes para os casos de

evidências biológicas de cenas de crimes e de cadáveres não identificados afronta os princípios éticos e humanitários e que vão além destas questões, pois contribuem para o recrudescimento dos crimes contra à vida na sociedade, na medida em que a prova material do delito – a vítima, não é identificada, logo, juridicamente a materialidade do crime é questionada.

A identificação genética é feita por meio da comparação de perfis de amostras de referência ou padrão com amostras questionadas colhidas de cenas ou das vítimas. Nestes e outros casos é possível a introdução destes perfis em banco de dados civil de pessoas desaparecidas, esforço já existente no país, porém ainda negligenciado como política de Estado. O princípio de funcionamento do banco de dados civil de perfis genéticos de pessoas desaparecidas requer a participação de peritos para a coleta de informações, como o tipo da amostra, as condições ambientais sob as quais estiveram e o tempo de exposição, e da recolha e acondicionamento de amostras biológicas para, enfim, serem analisadas por pesquisadores nos laboratórios de DNA forense a fim de se determinar o perfil genético. Neste sistema, a polícia e a sociedade civil organizada completam a rede de informações que alimentam o bancos de dados de DNA civil de pessoas desaparecidas de forma eficiente e com abrangência nacional na resolução de um grande número de casos em abertos e novos que ocorrem cotidianamente.

Para a presente pesquisa, as condições climáticas foram balizadas de acordo com com o modelo Köppen-Geiger, pelo qual considera a temperatura e a precipitação como as variáveis mais significativas para definição do clima de um dado lugar. Na zona de clima tropical do globo estão localizadas as cidades da costa oriental do nordeste do Brasil, regiões do Caribe e América Central, África central, Sul e Sudeste da Ásia e norte da Austrália, além de algumas áreas da Flórida (EUA) (KOTTEK, et al. 2006). Segundo Ayoade (2004) as diferenças registradas entre as médias mensais e anuais das variáveis climáticas das regiões de clima tropical são mínimas.

Diante das semelhanças climáticas entre países de clima quente e úmido considera-se que os resultados observados na presente pesquisa também possam ser reproduzidos nos lugares de clima tropical, sendo, possivelmente diferentes daqueles encontrados em regiões de climas diferentes. Ressalta-se também a importância destes estudos em países tropicais por serem, em geral, muito populosos,

subdesenvolvidos ou em desenvolvimento e com altas taxas de homicídios, principalmente América Latina e Caribe. O coeficiente de mortes por homicídios na América Latina e Caribe é o mais alto do mundo com 20/100.000 hab., enquanto que a média mundial é de 7/100.000 hab. (ONU-HABITAT, 2012). Na zona de clima tropical brasileira localizam-se seis capitais de Estados da região nordeste (Natal, João Pessoa, Recife, Maceió, Aracaju e Salvador) cuja média de homicídios é de 62,9/100.000 hab. contra a média nacional de 26,2/100.000 hab. (WAISELFISZ, 2011a).

Ademais, alguns países da zona tropical localizam-se em regiões acometidas frequentemente por desastres de massa, como terremotos, tsunamis, deslizamentos de terra, inundações, entre outros. Nesta matéria, o Brasil é o 10º país do mundo em número de vítimas de desastres de massa (TOMINAGA, SANTORO, AMARAL, 2009).

Assim, estudos sobre a degradação do DNA dentário revestem-se de grande importância para a resolução de casos de pessoas não identificadas em locais de clima tropical. A inexistência de informações na literatura acerca da degradação do DNA dentário submetidos às condições ambientais de clima e solo tropicais e do tempo de exposição traz dúvidas e imprecisão em relação a eficiência da genotipagem forense com DNA nuclear extraído de dentes utilizando marcadores padrão STRs para a obtenção de perfis genéticos conclusivos.

Os elementos do clima e do solo neste tipo de estudo não podem ser avaliados individualmente, e, por isso, não é possível inferir o quanto cada uma das variáveis contribue para a degradação do DNA, mas o produto da interação delas. Os resultados foram apresentados na perspectiva de discutir em qual grupo e intervalo de tempo de exposição T0, 4 meses (T1), 9 meses (T2) e 24 meses (T3) a síntese do clima e o do solo foram mais significativos sobre a intesidade e variabilidade da quantidade e qualidade do DNA.

Na extração de DNA, por ser uma das etapas mais importantes no processamento da amostra, especialmente quando se trabalha com amostras degradadas, foi dispensado o uso do fenol a fim de eliminar a exposição dos operadores a agentes tóxicos, bem como para evitar a produção de inibidores de PCR por esse agente. Para remover da solução possíveis inibidores da PCR e proteínas ligadas ao DNA nuclear, a solução foi concentrada em filtros Amicon Ultra – 4 e

purificadas em colunas de membrana de sílica com o kit de PCR QIAquick (QIAGEN). O pó dos dentes pulverizados foram pesados, sendo o peso médio de 1,5 g (dp ± 0,23).

Segundo Davoren et al. (2007) e Kim et al. (2008) a extração de DNA com sílica mostra melhores resultados do que a extração com fenol/clorofórmio de amostras de osso, e, também, pode otimizar a amplificação em PCR em amostras degradadas e DNA ancestral. De acordo com Seo et al. (2010) e Lee et al. (2010) a combinação da desmineralização total com a extração de DNA em membranas de sílica aumenta três vezes a quantidade de DNA recuperado. São esperadas diferenças dependendo do método de extração e utilização de kits comerciais, já que esta etapa é bastante sensível. Por isso, optou-se por utilizar na presente pesquisa um método comum de extração e que possa ser reproduzido facilmente.

Uma vez que na quantificação em PCR em tempo real havia um controle interno para cada reação, foi possível monitorar a presença de inibidores de PCR através do valor de Ct vic. Os resultados dos valores de Ct dentro do intervalo (23 – 32) indicavam a ausência de inibidores durante a amplificação da PCR. Nos grupos controles, os valores da quantificação foram considerados válidos mesmo na ausência de valores de Ct vic (controle interno), pois apresentaram valores de Ct baixo e ΔRn alto, ambos indicadores de alta concentração de DNA nuclear na reação e competição do DNA alvo com o IPC, suprimindo, assim, a amplificação destes na reação (Apêndice A). Em nenhum controle negativo foi detectado amplificação.

Para quantificar o DNA isolado, todas as amostras de DNA dentário foram mensuradas e os resultados apresentados em valores médios (tabela 1) e individualmente (apêndice A) ao longo dos tempos de exposição T0, 4 meses (T1), 9 meses (T2) e 24 meses (T3).

A quantificação do DNA foi possível em 60 amostras (92%), sendo que em cinco amostras do grupo experimental (uma amostra na superfície, duas na argila e duas na areia) no tempo T3 não foi possível determinar a quantidade de DNA, mesmo após novo processo de extração. No estudo de Rubio et al. (2009), a quantificação de DNA de dentes humanos com o kit Quantiblot foi possível em 100% das amostras (n = 8) com 24 meses de armazenamento à temperatura ambiente da sala.

Tabela 1. Média das quantidades de DNA (ng/µL) e o erro padrão dos grupos em diferentes tempos de exposição. Natal/RN, 2010 e 2012.

A diferença estatística significativa (p < 0,01) observada entre o grupo controle em relação ao grupo experimental na superfície, argila e areia no primeiro tempo de exposição (4 meses) e a ausência de variações significativas dentro dos grupos experimentais de T1 em relação a T2 demonstram a forte influência que a exposição ao ambiente exerceu para a diminuição da quantidade de DNA isolado já a partir da exposição em T1 (4 meses). Embora a atuação das condições ambientais tropicais tenha sido determinante para a diminuição da quantidade de DNA, a quantidade isolada em todas as amostras do tempo de exposição T1 permaneceu acima de 0,1 ng de DNA (< 0,1 ng aumenta as chances de alelos dropout) e em quantidades superiores àquelas consideradas ótimas (> 0,5 ng) para as reações de amplificação da maioria dos kits comerciais de STRs.

Em T2 e T3 as médias das quantidades de DNA dentro do grupo experimental não apresentaram diferenças significativas, com exceção do grupo superfície que foi significativo em T3 em relação a T1. Apesar de não haver diferenças significativas (p > 0,05) entre os grupos experimentais em T2 e T3, é notável o decaimento das quantidades de DNA em T3 em relação ao tempo de exposição T2 e, principalmente, em relação a T1. No tempo T2, três amostras apresentaram quantidades menores a 0,1 ng e nove amostras menores que 0,5 ng. Em T3, todos os casos em que foi possível a quantificação foram iguais ou inferiores a 0,1 ng. Estes resultados demonstram o

Tempo T0 T1 T2 T3

p

Grupo n média ep n média ep n média ep n média ep

Controle 5 36,6 ±4,7 5 28,4 ±6,5 5 34,0 ±2,1 5 39,4 ±5,6 0,471 Superfície --- --- --- 5 3,7 ±1,3 5 1,0 ±0,4 5a 0,05 ±0,02 <0,037 Argila --- --- --- 5 1,7 ±0,7 5 1,4 ±0,4 5b 0,06 ±0,02 0,166 Areia --- --- --- 5 1,9 ±1,0 5 0,2 ±0,06 5c 0,01 ±0,009 0,133 p <0,01 <0,01 <0,01 p < 0,05 estatisticamente significativa. a

uma amostra não quantificada.

b

duas amostras não quantificadas.

c

efeito das condições ambientais na redução gradual da quantidade de DNA isolado à medida que aumenta o tempo de exposição. Por conseguinte, depreende-se que a coleta de dentes dos locais de crime e cenários de desastres deve ser realizada no menor espaço de tempo possível a fim de se obter quantidade de DNA suficiente para análises com STRs.

Os dentes expostos na superfície do solo ao longo de T3 apresentaram alterações na estrutura macroscópica, como fissuras superficiais e profundas e porosidades na região radicular (Figura 25). Estes achados morfológicos estão de acordo com a diminuição da quantidade de DNA observada neste grupo a qual foi significativa (p < 0,037) a variação da média de quantidade em relação aos dentes do tempo de exposição T1.

Dentre os grupos experimentais, o grupo areia foi aquele que apresentou a maior redução das quantidades de DNA isolado nas amostras. Os dentes enterrados no solo arenoso permaneceram sob efeitos de pH de forte à moderadamente ácidos, além de, fatores que devido às características da textura da areia tornam este solo mais frouxos e permeáveis a lixiviação, o que pode ter contirbuído para a maior diminuição da quantidade de DNA isolado nas amostras enterradas neste ambiente. Também admite-se que na areia a microbiota local possa ser diferente da encontrada na argila.

A comparação das quantidades médias de DNA do grupo controle em T0, T1, T2 e T3 não revelou variações estatisticamente significativas (p > 0,05), não tendo, portanto, a variável tempo influenciado na redução da quantidade de DNA dos dentes armazenados em sala e protegidos da radiação ultravioleta. Em estudo realizado por Rubio et al. (2009) constataram a diminuição significativa da quantidade de DNA dentário entre dentes frescos e dentes com 24 meses de armazenamento à temperatura da sala, sendo que a quantidade permaneceu estável após este tempo.

Na presente pesquisa os dentes arrolados não foram dentes frescos, uma vez que o início dos experimentos ocorreu após cerca de 45 dias da cirurgia oral. Logo, a quantidade de DNA dos dentes pode ter sofrido diminuição imediatamente após a cirurgia oral e antes da quanticação em T0 e se mantido estável ao longo dos tempos T1, T2 e T3 no grupo controle. Este resultado, segundo Johnson e Ferris (2002) e Boy, Bernitz e Heerden (2003) pode ser explicado porque a degradação do DNA inicia-se

logo após a morte, de poucas horas a vários dias. Em estudo com dentes armazenados à temperatura ambiente da sala, Rubio et al. (2013) relatam a diminuição significativa da concentração de DNA no primeiro mês após a cirurgia oral e se mantido estável após 30 dias até 12º mês. Sendo a quantidade de DNA um dos fatores associados ao sucesso da tipificação genética, a análise do DNA de dentes armazenados em temperatura ambiente, protegidos da luz e arejados oferece quantidades maiores de DNA do que extrações realizadas após 30 dias da morte quando se observa um decaimento significativo.

A eficiência da amplificação dos 17 loci de STRs utilizados nesta pesquisa foi avaliada por meio do número médio de STRs amplificados nas amostras. Os resultados das médias são apresentadas na tabela 2 ao longo dos tempos T0, 4 meses (T1), 9 meses (T2) e 24 meses (T3).

Tabela 2. Média do número de loci de STRs amplificados em e o erro padrão dos grupos em diferentes tempos de exposição. Natal/RN, 2010 e 2012.

A amplificação de pelo menos um STR foi possível em 60 amostras (92%), tendo a amplificação falhado para todos os marcadores em cinco amostras do grupo experimental (uma amostra na superfície, duas na argila e duas na areia) do tempo de exposição T3, mesmo após nova extração do DNA.

No grupo experimental, a exposição dos dentes às condições de clima e de solo não resultou na diminuição significativa no número médio de loci de STRs amplificados (p > 0,05) nos tempos de exposição T1 (4 meses) e T2 (9 meses). No tempo T1, a

Tempo T0 T1 T2 T3

p

Grupo n média ep n média ep n média ep n média ep

Controle 5 15,8 ±1,0 5 16 ±0,4 5 16,2 ±0,8 5 16,8 ±0,2 0,748 Superfície --- --- --- 5 14,6 ±1,4 5 14,6 ±1,3 5a 3,2 ±0,5 <0,01 Argila --- --- --- 5 16,6 ±0,4 5 12 ±1,7 5b 3,0 ±1,1 <0,01 Areia --- --- --- 5 15,6 ±0,2 5 11 ±1,3 5c 1,6 ±0,3 <0,01 p 0,272 0,063 <0,01 p < 0,05 estatisticamente significativa. a

uma amostra não amplificada.

b

duas amostras não amplificadas .

c

eficiência de amplificação acima de 90% no grupo experimental encontra respaldo na quantidade de DNA isolado em níveis suficientes (0,3 ng < [DNA] < 8,6) para a reação.

Os resultados da eficiência em T2 e T3 podem ser comparados com os resultados da quantificação do DNA nos mesmos tempos. Nos tempos T2 e T3 a redução da quantidade de DNA foi acompanhada pela redução da média do número de loci de STRs amplificados, sendo mais intensos os efeitos do ambiente na diminuição da quantidade e aumento de falhas de amplificaçãodo à medida que aumenta o tempo de exposição a partir de T1.

A comparação das médias do número de loci de STRs amplificados no grupo controle em T0, T1, T2 e T3 não revelou variações estatisticamente significativas (p > 0,05), isto é, a variável tempo não influenciou na redução da média de loci de STRs amplificados nos dentes armazenados à temperatura ambiente e protegidos da luz.

Embora os resultados não mostrem variações significativas entre as médias do número de loci de STRs amplificados entre os grupos nos tempos de exposição T1, T2 e T3, observa-se a produção de perfis genéticos parciais, pois nem todos os casos amplificaram 100% dos marcadores utilizados na pesquisa. A obtenção de perfis parciais em T1 e T2 devido às falhas de amplificação de alguns marcadores, principalmente os de maior tamanho, não significa necessariamente na determinação de resultados inconclusivos, uma vez que a determinação de perfis genéticos conclusivos depende muito mais do objetivo da perícia (cívil ou criminal), das frequências dos polimorfismos na população estudada e de quanto é o poder de discriminção do conjunto de marcadores amplificados no caso (PINHEIRO, 2010). Assim, perfis parciais podem gerar resultados conclusivos e capazes de solucionar um grande número de casos em âmbito forense.

A amplificação do conjunto de loci de STRs nos grupos controle, superfície, argila e areia ao longo dos tempos foi expressa em valores percentuais conforme a Figura 12.

Milos et al. (2007) pesquisaram o sucesso de amplificação de STRs de diferentes amostras de 25 mil esqueletos do conflito dos Balcãs enterrados em valas comuns em regiões de clima temperado. A exumação dos ossos ocorreu entre 2000 e 2007 e as amostras ósseas e dentárias foram acondicionadas a 10 °C durante todo o período de identificação. Neste estudo, os autores consideraram como sucesso a amplificação de

12 ou mais marcadores de 16 loci de STRs utilizados. Análises em cerca de 7 mil molares, pré-molares e caninos íntegros mostraram um sucesso de amplificação em