multivariada e resolução de curvas
3. Tratamento dos dados
3.4. Quantificação pixel-a-pixel dos constituintes nos filmes utilizando MCR ALS
O algoritmo MCR-ALS foi executado apenas na faixa espectral 4000-5110 cm-1
(região espectral formada predominantemente por bandas de combinação), com o objetivo de eliminar regiões constituídas basicamente por linhas de base e primeiro sobretom C-H e O-H (números de onda maiores que 6000 cm-1), nas quais havia total sobreposição da maioria das bandas, dificultando a resolução. Além disso, a utilização de menos variáveis tornou o processo computacional significativamente mais rápido. A matriz S0 (estimativas iniciais de S) foi
formada pelos espectros puros de referência de cada constituinte dos filmes (após o mesmo pré- processamento utilizando nos espectros das amostras); portanto, o pseudoposto matemático dos dados foi considerado o mesmo que o posto químico. É importante ressaltar que os espectros puros dos polímeros foram obtidos seguindo o mesmo procedimento experimental utilizado no preparo das amostras (i.e. método da evaporação do solvente) para cada polímero puro. Esta decisão é fundamental para minimizar, dentro do possível, erros em C decorrentes de efeito de matriz. As restrições aplicadas para o MCR-ALS para minimizar a ambiguidade rotacional foram: i) não-negatividade em C e ii) correspondência entre espécies, através do qual um posto matemático igual a 3 foi forçado nos pixels correspondentes às amostras com ausência do PAR (formulações 5, 7 e 15, Tabela 2). O critério de convergência para a finalização do processo iterativo por ALS adotado foi o erro entre duas sucessivas iterações menor ou igual a 0,01 %. A resolução das concentrações relativas dos polímeros e do fármaco nos pixels foi realizada arranjando os dados pré-processados na forma de matrizes aumentadas (DCAL), construídas de
acordo com três estratégias analíticas distintas (denominadas A, B e C) inicialmente propostas por Piqueras e colaboradores (Piqueras et al., 2012).
Estratégia A:
- Os espectros desdobrados de todas as formulações foram concatenados em uma única matriz DCAL (pixels totais, λ), que foi então resolvida por MCR-ALS.
- A matriz resolvida CCAL foi dividida em 17 submatrizes, cada uma
correspondendo às concentrações relativas de cada constituinte nos pixels de cada formulação. - Cada uma das 17 submatrizes foi dividida em 2 metades, e então as concentrações relativas médias de cada composto 𝑐̅𝑀𝐶𝑅(𝑖) (i = HPMC, PVP, PEG ou PAR) em cada metade foram calculadas.
- Os valores de 𝑐̅𝑀𝐶𝑅(𝑖) provenientes das primeiras metades de cada uma das submatrizes foram utilizadas para construção de um modelo de calibração univariado, estabelecendo-se uma regressão linear entre 𝑐̅𝑀𝐶𝑅(𝑖) e os valores conhecidos de concentração
média de cada polímero (𝑐̅𝑅𝐸𝐹(𝑖)) em cada formulação (veja Tabela 2). Os valores de 𝑐̅𝑀𝐶𝑅(𝑖)
calculados das segundas metades de cada submatriz foram utilizados para validação dos modelos de calibração univariados, utilizando, novamente, os valores de referência da Tabela 2.
Um esquema desta estratégia de quantificação, utilizando regressão univariada a partir dos resultados obtidos do MCR-ALS, está disposto na Fig. 12.
Os erros de calibração (RMSEC) e validação (RMSECV) médios das concentrações relativas médias do modelo de calibração univariado do tipo 𝑐̅𝑀𝐶𝑅(𝑖) = 𝑎. 𝑐̅𝑅𝐸𝐹(𝑖) + 𝑏 e bias
foram calculados conforme as eqs. 11 e 12.
n i ref C i val corr V RMSEC
2 )) ( ) ( / C ( (11) n i ref C i val corr bias
(C / () ()) (12)em que 𝑐̅𝐶𝑂𝑅𝑅(𝑖) é a concentração relativa média da espécie i numa dada formulação corrigida
Figura 12. Esquema da estratégia A para a quantificação pixel-a-pixel dos constituintes nos filmes a partir de resultados de concentração relativa resolvidos por MCR-ALS. 𝑐
̅
𝑉𝐴𝐿(
𝑖)
corresponde aos valores de concentração relativa média computados na etapa de validação do modelo univariado. Adaptada da ref. (Piqueras et al., 2012).
As concentrações relativas de cada constituinte resolvidas em cada pixel (𝑐𝑀𝐶𝑅(𝑖))
podem ser corrigidas com base no modelo de calibração univariado construído, utilizando a eq. 13. O redobramento de 𝑐𝐶𝑂𝑅𝑅(𝑖) conforme as posições originais dos pixels produzirá as imagens químicas detalhando as distribuições quantitativas de cada espécie química em cada um dos filmes.
𝑐𝐶𝑂𝑅𝑅(𝑖) = 𝑐𝑀𝐶𝑅(𝑖)−𝑏
𝑎 (13)
Estratégia B
- As matrizes desdobradas contendo os espectros pré-processados de cada formulação foram redobradas de acordo com o arranjo tridimensional original (XxYxλ), e então os dados de cada formulação foram divididos em duas metades.
- As primeiras metades dos arranjos de 3 modos foram novamente desdobradas e concatenadas na matriz aumentada DCAL, e em seguida resolvidas por MCR-ALS. Os valores
de 𝑐̅𝑀𝐶𝑅(𝑖) foram calculados de CCAL, e o modelo de calibração univariado 𝑐̅𝑀𝐶𝑅(𝑖) =
𝑎. 𝑐̅𝑅𝐸𝐹(𝑖) + 𝑏 foi ajustado para cada constituinte i.
- As segundas metades dos arranjos de 3 modos foram desdobradas, e então concatenadas na matriz aumentada VAUG, para fins de validação.
- Os perfis de concentração relativa dos constituintes em VAUG (CVAL) foram
resolvidos utilizando a equação CVAL = VAUGSCAL(STCALSCAL)−1, em que SCAL corresponde à
matriz contendo os espectros dos constituintes puros otimizados pelo MCR-ALS na etapa de calibração.
- As eqs. 11-13 são utilizadas para o cálculo das figuras de mérito correspondentes e, finalmente, para obter as imagens químicas de cada espécie nas formulações.
Um esquema da estratégia B encontra-se na Fig. 13.
Figura 13. Esquema da estratégia B para quantificação pixel-a-pixel dos constituintes nos filmes a partir de resultados de concentração relativa resolvidos por MCR-ALS. STCAL+
corresponde à pseudoinversa de ST
Estratégia C
- As estratégias de calibração e de validação são realizadas de forma semelhante à estratégia empregada para os modelos PLS. As matrizes desdobradas das formulações 1-12 são concatenadas na matriz aumentada de calibração DCAL, e as formulações 13-17 são
concatenadas na matriz de validação VAUG.
- DCAL é resolvida por MCR-ALS, e os modelos de calibração univariados são
ajustados para cada espécie química, da mesma forma que nas estratégias anteriores.
- As concentrações relativas das espécies nas amostras de validação são resolvidas por CLS; CVAL = VAUGSCAL(STCALSCAL)−1, semelhante à estratégia B. As figuras de mérito dos
modelos assim como as imagens químicas das amostras são obtidas da mesma forma que nas demais estratégias.
Um esquema da estratégia C encontra-se na Fig. 14.
Figura 14. Esquema da estratégia C para quantificação pixel-a-pixel dos constituintes nos filmes a partir de resultados de concentração relativa resolvidos por MCR-ALS. Adaptada da ref. (Piqueras et al., 2012).