R ESULTADOS E D ISCUSSÃO

Os valores das absorvâncias obtidas pelas diferentes concentrações de ofloxacino, substância de referência (padrão) e amostra são demonstradas na Tabela 19.

Tabela 19 - Valores das absorvâncias obtidas no método turbidimétrico durante o teste

de linearidade P1 (6 μg/mL) P2 (12 μg/mL) P3 (24 μg/mL) A1 (6 μg/mL) A2 (12 μg/mL) A3 (24 μg/mL) 1 0,633 0,602 0,581 0,631 0,580 0,580 2 0,817 0,721 0,520 0,772 0,641 0,605 3 0,737 0,649 0,606 0,780 0,733 0,552 Média 0,729 0,658 0,569 0,728 0,651 0,579 DPR% 12,701 9,119 7,775 11,500 11,850 4,637

P = padrão; A = amostra. *Cada valor corresponde a média de três determinações

Figura 3 - Curvas analíticas de soluções de ofloxacino, substância referência, e amostra, em concentrações de 6,0; 12,0 e 24,0 μg/mL, obtidas pelo método turbidimétrico.

As curvas analíticas de ofloxacino substância referência e amostra (Figura 3) foram construídas com as médias dos valores das absorvâncias de três curvas

analíticas obtidas durante os ensaios. As equações da reta, determinadas pelo método dos mínimos quadrados, são: y = -0,1371ln(x) + 1,0325, com um coeficiente de determinação (R2) igual a 0,9969, para o ofloxacino substância referência e y = - 0,1438ln(x) +1,0728 com R² = 0,9953, para o fármaco em solução oftálmica.

Fazendo uma análise visual do gráfico é possível observar que ele não apresenta paralelismo, já que as retas se cruzam. O paralelismo é um dos requisitos obrigatórios para se concluir a validação.

A ANOVA calculada para os dados das curvas analíticas de ofloxacino é mostrada na Tabela 20.

Tabela 20 - Análise da variância dos dados obtidos no ensaio microbiológico do ofloxacino pelo método turbidimétrico

*significativo para p<0,05; GL: graus de liberdade; SQ: soma dos quadrados; QM: variância

Os resultados encontrados pela ANOVA do ensaio turbidimétrico seriam suficientes para validar o método, uma vez que os valores de razão de variância (Fcalculado e Ftabelado) dos três parâmetros críticos estão de acordo com os

requerimentos farmacopeicos. O “desvio de paralelismo” e o “desvio de linearidade” foram não significativos e a “regressão linear” foi significativa; desta forma os requisitos mínimos necessários para validar o método seriam alcançados, se a curvas não se cruzassem. Diante desses resultados, o método não apresentou o paralelismo necessário para a validação.

O cálculo da potência foi realizado através da equação de HEWITT (HEWITT, 2004), sendo que os ensaios foram realizados em 3 dias diferentes e cada ensaio representa a média de três determinações.

Equação de Hewitt: Potência (%) = Antilog M x 100 Na qual: M = F/b b = E/I E = ¼ x [(A3 + P3) – (A1 + P1)] F = ¼ x [(A1 + A2+ A3) – (P1 + P2 + P3)] I = logaritmo da razão das doses

Os valores da potência de ofloxacino em solução oftálmica são demonstrados na Tabela 21.

Tabela 21 - Valores experimentais obtidos para o doseamento de solução padrão de ofloxacino, pelo método turbidimétrico

Dia Potência (%)* Média DPR (%)

1 96,42

2 99,63 99,44 2,94

3 102,26

*Cada valor corresponde à média de três determinações

Na tabela 22 são apresentados os valores de recuperação para cada nível de concentração-teste pelo método turbidimétrico.

Tabela 22 - Valores experimentais obtidos na exatidão do ofloxacino padrão, no ensaio microbiológico pelo método turbidimétrico

Recuperação* (%) Recuperação média (%) DP DPR% R1 71,242 R2 100,45 86,447 14,641 16,936 R3 87,650

*Os valores da recuperação apresentados correspondem a média de três determinações.

A precisão foi avaliada pelo coeficiente de variação, os valores da precisão intradia, interdia e entre analistas foram de 5,628%, 8,678% e 6,419%, respectivamente, e os valores estão demonstrados nas tabelas 23, 24 e 25.

Tabela 23 – Valores de absorvâncias medidas durante o teste de precisão intradia. Leitura Absorvância em 12μg/mL 1 0,627 2 0,642 3 0,615 4 0,614 5 0,688 6 0,698 7 0,686 DPR% 5,628

Tabela 24 - Valores de absorvâncias medidas durante o teste de precisão interdia Dia Absorvância em 12μg/mL 0,576 1 0,615 0,614 0,732 2 0,720 0,712 0,694 3 0,629 0,624 DPR% 8,678

Tabela 25 - Valores de absorvâncias medidas durante o teste de precisão e entre analistas

Analista Absorvância em 12μg/mL 0,600 1 0,691 0,598 0,576 2 0,615 0,614 DPR% 6,419

A robustez do método foi determinada pela variação do comprimento de onda de leitura no espectrofotômetro e os valores estão demonstrados na tabela 26. Tabela 26 - Valores da determinação da robustez do método turbidimétrico, na concentração

12,0μg/mL

*corresponde à média de três determinações

P2 (12μg/mL)* Potência (%) Média Desvio Padrão DPR (%) 528 nm 0,626 86,066 98,944 11,154 11,273 530 nm 0,658 105,255 532nm 0,647 105,512

No desenvolvimento do método turbidimétrico para solução oftálmica ofloxacino as concentrações testadas da amostra variaram de 1,5 a 48,0 μg/mL. Com os testes preliminares, foram escolhidas as concentrações 12,0; 24,0 e 48,0 μg/mL, pois apresentaram a melhor resposta frente ao micro-organismo e mantiveram a correlação entre a dose e a resposta da substância em análise, como recomendado pela Farmacopeia Brasileira (2010). A utilização do micro-organismo S. epidermidis baseia-se na facilidade de crescimento, manuseio e manutenção deste micro-organismo, além da sua sensibilidade frente ao ofloxacino.

Apesar das curvas analíticas apresentarem linearidade, elas não tem paralelismo, o que inviabiliza a conclusão da validação. A análise estatística demonstrou que não existe desvio da linearidade nas curvas analíticas originadas da substância química de referência e amostra. Os coeficientes de correlação são 0,9969 e 0,9953 para a substância química de referência e para as amostras, respectivamente, valores dentro do recomendado.

O doseamento foi calculado pela média das potências, com valor igual a 99,44% e apresentou coeficiente de variação igual a 2,94%, limite dentro do recomendado (BRASIL, 2003a).

A precisão do teste foi confirmada pelos testes de precisão intradia, interdia de e entre analistas, 5,628, 8,678 e 6,419%, respectivamente. Confirmando a precisão do método para análise de solução oftálmica de ofloxacino.

No teste de exatidão, obteve-se recuperação média encontrada de 86,447%. Esse valor é baixo e o teste ainda apresentou um desvio padrão relativo com valor 16,936%, valor esse acima do aceitável. Por se tratar de um método biológico, esse poderia ser um valor aceitável, caso o DPR% apresentado fosse menor que 15%.

O método se mostrou robusto para a variação do comprimento de onda de leitura no espectro. O valor do desvio padrão relativo foi 11,273%, valor este que respeita o limite aceitável para um ensaio microbiológico (BRASIL, 2003a). Durante a etapa de validação a robustez do método também foi testada variando-se o tempo de incubação no shaker, porém este parâmetro não se demonstrou robusto logo é importante seguir rigorosamente o tempo de incubação, para que não ocorram variações no ensaio.

Dessa forma, resultados obtidos não apresentaram o paralelismo e a exatidão necessária para concluir o desenvolvimento do método e posterior validação.

7. CONCLUSÃO

Os métodos analíticos físico-químicos são, em geral, mais atrativos, devido, entre outros fatores, a alta precisão que apresentam. No entanto, eles não fornecem verdadeira indicação sobre a atividade biológica das substâncias e, ao se tratar de fármacos com atividade antimicrobiana, a determinação da potência por meio de métodos microbiológicos ganha importância.

A atividade de antibióticos pode ser demonstrada através do efeito inibitório sobre o crescimento microbiano. Ou seja, uma pequena alteração na atividade antimicrobiana pode demonstrar alguma alteração pequena, que não seriam detectáveis por métodos químicos.

O método turbidimétrico considera a relação entre a proporção de crescimento de população microbiana no meio líquido e a concentração da substância ensaiada, sendo muito utilizada para doseamento de antimicrobianos e vitaminas.

Este método apresenta algumas vantagens, como rapidez, facilidade operacional, medida objetiva da resposta, maior sensibilidade a baixas doses, ausência de efeitos de difusão e exatidão.

Os métodos microbiológicos são os únicos capazes de determinar a potência de agentes antimicrobianos e, embora consumam maior tempo de análise, esta desvantagem pode ser praticamente eliminada com a validação do ensaio turbidimétrico.

Uma das vantagens dos métodos microbiológicos é não necessitar de equipamentos especializados e de alto custo, além de não utilizar solventes potencialmente tóxicos para o analista e para o meio ambiente. Apresenta ainda outras vantagens, como rapidez, desempenho relativamente simples e facilidade operacional, medida objetiva da resposta, maior sensibilidade a baixas doses, ausência de efeitos de difusão e exatidão. Porém muitos aspectos devem ser considerados no seu desenvolvimento para garantir que eles sejam suficientemente seguros e exatos, tais como: temperatura de incubação, micro-organismo utilizado, robustez do método, vidrarias calibradas, entre outras características.

A desvantagem deste método é não poder ser aplicado a soluções turvas e coloridas e a formulações com substâncias ativadoras ou inibidoras de crescimento microbiano, pois elas interferem na leitura dos resultados. Necessita também de um equipamento para leitura da resposta e deve é imprescindível a ausência de contaminação grosseira interfiram na leitura fotométrica. O método é também menos preciso comparado ao método de difusão em ágar.

Foi realizado o desenvolvimento de um método analítico para quantificação de ofloxacino colírio por turbidimetria. Durante o desenvolvimento do método estabeleceu-se os parâmetros que apresentavam melhor resposta.

No estudo de validação, foram aplicados os parâmetros de linearidade, precisão, exatidão e robustez, utilizando a substância química de referência de ofloxacino e a amostra de solução oftálmica de ofloxacino, nas concentrações 12,0, 24,0 e 48,0 μg/mL, empregando-se o micro-organismo Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 IAL 2150.

Os parâmetros estudados para a validação do método analítico para quantificação do ofloxacino não atenderam a todas as especificações recomendadas. Dessa forma, os resultados obtidos na tentativa da validação, foi negativo, e portanto, não foi possível validar o método. Assim sendo, pode-se concluir que este trabalho de conclusão de curso, não conseguiu atingir seu objetivo que era de desenvolver e validar uma metodologia analítica. O método demonstrou desenvolvimento complexo e trabalhoso e não apresentou o paralelismo e exatidão necessários para validação.

Pode-se enumerar diversos fatores para o desenvolvimento do método não ter apresentado resultado satisfatório. Os ensaios devem ser realizados com equipamentos e instrumentos dentro das especificações, funcionando corretamente, adequadamente calibrados e validados. O operador precisa ter conhecimento suficiente sobre o trabalho sendo capaz de tomar as decisões apropriadas durante a realização do estudo. Além disso, os materiais utilizados nos ensaios devem ser usados exclusivamente durante o desenvolvimento e validação para evitar contaminação, e devem ser adequadamente lavados, e durante o desenvolvimento desse trabalho, foi necessário dividir as vidrarias, o que impedia o uso exclusivo. As cepas dos micro-organismos podem se apresentar estressadas, dependendo das condições do laboratório, de preparo, incubação, do clima e esses fatores não

podem ser controlados, por isso os métodos microbiológicos são delicados de se trabalhar.

O desenvolvimento desse trabalho possibilitou aplicar conhecimentos teóricos e práticos adquiridos em aula e aprofundá-los de acordo com os temas abordados e o ensaio realizado. O trabalho proporcionou também acréscimo de conhecimento através da realização de pesquisas em bancos de dados e levantamento bibliográfico. Contribuiu também para o desenvolvimento do pensamento crítico e científico, principalmente ao deparar-me com dificuldades e imprevistos durante a realização do projeto.

8. REFERÊNCIAS

BIBLIOGRÁFICAS

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7. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº 899 de 29 de maio de 2003. Aprova o guia para validação

de métodos analíticos e bioanalíticos. Diário Oficial da União. Brasília, 02 de junho de 2003, seção 1.

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