Ranqueamento de peptídeos (Figura 4, item 3)

Para posterior verificação da frequência e variância dos peptídeos em assinaturas com boa acurácia na predição das classes N+/N0 e entre as top-10

posições dos ranques, os dados foram submetidos a 40 ranqueadores diferentes. Tais métodos de ranqueamento se baseiam em classificadores ou testes estatísticos para calcular um peso (nota) para cada peptídeo (Figura 5). Cada conjunto de pesos (40 para cada peptídeo) é escalonado entre 0 e 1, sendo 1 a melhor nota. Exemplos de modelos utilizados para extrair tais pesos são SVM, Árvores de Decisão e teste-t de Student. Detalhes sobre as 40 abordagens utilizadas são detalhadas em Computational methods in Biology: cancer biomarkers, protein networks and lateral gene transfer de Henry Heberle, 2019.

Em cada análise realizada, uma amostra ou mais foram ignoradas em cada execução do pipeline de análise proposto por Heberle (2019). Esse procedimento foi realizado para que a estabilidade dos peptídeos nos diferentes ranques e assinaturas também fosse estudado. Assim, foi realizada uma validação cruzada, formando 14 conjuntos de amostras diferentes. Em cada um destes conjuntos, uma amostra do grupo N0 e duas amostras aleatórias do grupo N+ foram retiradas. Cada conjunto de amostras restantes foi submetido a análise pelos 40 ranqueadores, resultando em 560 (40*14) diferentes ranques.

Cada ranqueador atribui um peso para cada peptídeo. Estes pesos são utilizados para gerar um ranque. O agrupamento hierárquico exibido na Figura 6a representa os 50% maiores pesos de cada proteína (linhas no agrupamento hierárquico) em cada um das 14 folds (14 colunas no agrupamento hierárquico). Isto é, para cada proteína, em cada fold, temos 40 pesos. Os 20 maiores pesos são usados para calcular uma média. Esta média é exibida no agrupamento hierárquico em questão e o processo para a construção deste agrupamento hierárquico é ilustrado na Figura 5.

Figura 5. Ilustração da construção do agrupamento hierárquico. Neste exemplo temos 4 ranqueadores e 3 peptídeos que estão sendo avaliados, e 3 conjuntos de amostras diferentes (fold 1, 2, e 3). No agrupamento hierárquico final, temos para o Peptídeo 1, Fold 1, a média entre seus 50% maiores pesos extraídos da tabela Fold 1; isto é, 50% maiores entre 1, 1, 0.8 e 0,75 é 1 e 1, resultando em média 1. O processo é repetido para fold 2 e fold 3, e para os demais peptídeos.

A utilização de 50% maiores valores foi escolhida para termos uma abordagem positivista, em que consideramos as maiores notas de cada peptídeo. Todos os peptídeos têm a mesma chance de obter 20 boas notas. Peptídeos com pesos ruins entre os 20 maiores acabam com uma média ruim. Entende-se aqui que peptídeos que obtém pesos altos somente em casos muito específicos possuem um risco maior de serem falsos positivos. Portanto, se mesmo desconsiderando os 20 mais baixos pesos o peptídeo tem uma média ruim, o mesmo é ignorado. Note que, pode acontecer de que, por exemplo, em uma (ou mais) execução das 14, um peptídeo tem média ruim; e nas demais 13 execuções, possui média boa. Essa informação é expressa pelas colunas do agrupamento hierárquico da Figura 5a e indica a estabilidade perante a pequenas alterações do conjunto de dados. Em outras palavras, quanto maior é a variação de cor de uma linha do agrupamento hierárquico

(peptídeo), maior é a instabilidade; indicando que ao variar 3 amostras, o peso que os ranqueadores atribuíram variou também.

Figura 6. Avaliação da frequência dos peptídeos dentro dos ranqueadores por agrupamento hierárquico. a) Agrupamento hierárquico dos 50% maiores pesos atribuídos aos peptídeos pelos 40 classificadores em cada uma das 14 execuções (colunas);

3.10.2 Classificação dos peptídeos em “boas”, “ótimas” e “melhores” assinaturas (good, even better and best)

Outra análise realizada para a priorização de peptídeos foi a avaliação do poder de predição das pequenas assinaturas construídas a partir dos ranques. Em resumo, as respectivas assinaturas foram divididas em três principais grupos: good, even better e best. O primeiro, good, se trata de um grupo mais geral de assinaturas de alta acurácia, por exemplo entre 90% e 95%; o segundo (even better) já é um pouco mais restrito, entre 93% e 95%, e o terceiro (best) é ainda mais restrito, equiparando com a seleção de apenas assinaturas de máxima acurácia. (Heberle, 2019).

3.10.3 Cálculo e avaliação do valor da razão da intensidade dos peptídeos entre N+ e N0.

A razão N+/N0 é baseada no cálculo da intensidade dos peptídeos de cada proteína. Assim, a razão N+/N0 da intensidade de cada peptídeo foi calculada pela média das amostras N+ dividida pela média de N0. Os peptídeos com valores de razão abaixo de 1,5 foram desconsiderados para essa seleção.

3.10.4 Análise da variação da intensidade dos peptídeos entre as amostras.

Uma outra análise realizada para priorização dos peptídeos foi o cálculo da a variação da intensidade dos peptídeos entre as diferentes amostras. O coeficiente de variação foi calculado para cada um dos peptídeos. Os peptídeos considerados na seleção foram os que tiveram os menores coeficientes de variação. O coeficiente de variação foi calculado pela razão do desvio padrão pela média de cada peptídeo.

Correlação dos peptídeos diferencialmente abundantes e selecionados para quantificação ‘absoluta’ com os dados clinicopatológicos.

Peptídeos diferencialmente abundantes selecionados para a quantificação ‘absoluta’ foram comparados às variáveis clínicas e patológicas dos pacientes utilizando os testes de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis, qui-quadrado, regressão linear e correlação de Pearson. As variáveis clinicopatológicas avaliadas foram: sexo, idade, status TNM (classificação dos tumores de acordo com o tamanho, presença de

metástases em linfonodo e metástase a distância), estadiamento, localização do tumor, progressão da doença, estado atual do paciente (vivo ou morto), sobrevida, tabagismo e etilismo.

O poder de cada peptídeo para discriminar pacientes N0 ou N+ foi avaliada pela construção de curvas ROC (Receiver Operating Characteristic Curve) associada à regressão logística. Um valor de p<0,05 foi utilizado para determinação de significância e os testes estatísticos foram realizados nos programas GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, http://www.graphpad.com) e SPSS Statistics 17 (IBM, NY, EUA).

As informações disponibilizadas foram obtidas do prontuário clínico dos pacientes e atualizadas em julho de 2019.

RESULTADOS

As 64 proteínas deste projeto foram monitoradas em 2 métodos distintos, mas analisadas todas em conjunto. Desde a etapa de otimização até a análise final dos dados, o número de peptídeos monitorados diminuiu de acordo com a evolução do desenvolvimento do método. Isso aconteceu porque alguns peptídeos não puderam ser monitorados, seja porque não haviam transições suficientes para serem monitoradas pelos critérios estabelecidos de pelo menos 3 transições por peptídeo, ou mesmo porque alguns peptídeos não foram identificados após todas as etapas de otimização realizadas. Assim, a Figura 7 apresenta o número de peptídeos do início ao fim do desenvolvimento do método SRM.

Figura 7. Número de peptídeos após cada etapa de estudo. Na primeira etapa, de seleção e síntese dos peptídeos para a quantificação ‘absoluta’, 192 peptídeos foram sintetizados. Após desenvolvimento de otimização do método SRM, 175 peptídeos foram monitorados. Após análise manual dos espectros, 142 peptídeos foram considerados confiáveis na quantificação relativa. A análise estatística resultou em 67 peptideos diferencialmente abundantes entre os grupos N+ e N0. Finalmente após aplicação dos critérios descritos anteriormente, 5 peptídeos foram selecionados para quantificação ‘absoluta’.

Os números de proteínas, peptídeos e transições monitorados em cada um dos métodos finais são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2. Número de proteínas, peptídeos e transições monitorados em cada método.

Método 1 Método 2

Proteínas 41 23

Peptídeos 113 61

Transições 339 183

As amostras foram analisadas em triplicata, assim foi obtido um total de 240 arquivos de análises de amostras com os métodos 1 e 2. Esses arquivos foram

carregados no mesmo arquivo do Skyline utilizado para o desenvolvimento do método. O Skyline seleciona o pico correto dos peptídeos, mas houve revisão manual dos 101.760 picos para garantir que o indicado realmente pertencesse ao peptídeo monitorado, assim, como para garantir que outros aspectos como a co-eluição das transições, co-eluição dos peptídeos sintéticos e endógenos, e se o perfil das transições apresentado está de acordo com o esperado.

Figura 8. Volcano plot indicando as proteínas diferencialmente expressas na comparação entre os grupos N0 e N+ (teste de Wilcoxon Mann-Whitney, valor de p corrigido por FDR <0,05). Os pontos azuis indicam as proteínas com abundância diminuída no grupo N+ vs N0, enquanto o ponto vermelho indica a única proteína com abundância aumentada em N+.

Após finalizar a validação manual dos picos os dados foram submetidos para análise estatística utilizando a ferramenta R (v3.4.0). Os resultados destas análises mostram que a abundância de 32 proteínas está diminuída no grupo com metástase linfonodal (N+) e apenas uma proteína (A2MG) apresenta abundância aumentada quando comparadas com o grupo sem metástase (N0) pelo teste de Wilcoxon Mann-Whitney p-valor <0,05 corrigido pela razão N+/N0, mostrando assim que há diferenças relevantes na expressão de proteínas entre pacientes que apresentam ou não metástase linfonodal (Figura 8). Este fato é grande relevância, visto que a presença de metástases linfonodais é um dos principais fatores que determinam um pior prognóstico ao paciente.

Após avaliação da existência de diferença na abundância das proteínas entre os pacientes com e sem metástase linfonodais, utilizamos estratégias de aprendizado de máquina e estatística para priorizar as proteínas para a próxima etapa de validação por quantificação ‘absoluta’, com o uso de diversas métricas como curva de calibração com peptídeos sintéticos de alta pureza, que no caso será utilizado >98% de pureza.

Para priorizar os peptídeos para a próxima fase, foram considerados os seguintes critérios: i) abordagens de aprendizado de máquina e estatística; ii) análise do coeficiente de variação de peptídeos dentro do grupo amostral; iii) razão de intensidade em nível de peptídeos entre N+/N0.

i) Inicialmente foi avaliada a frequência dos peptídeos entre as amostras. Para isso, um pipeline desenvolvido por Heberle (2019) foi utilizado. Nesse pipeline as amostras foram avaliadas em 14 diferentes conjuntos de amostras, ou seja, em cada conjunto de

amostras, 1 amostra do grupo N0 e 2 amostras aleatórias do grupo N+ foram removidas e a frequência dos peptídeos nas amostras restantes foi avaliada por 40 métodos ranqueadores distintos. Esses ranqueadores atribuem pontuações para cada peptídeo variando de 0 a 1. Portanto, os peptídeos com as pontuações mais próximas de 1 (em vermelho no gráfico) em um maior número de conjunto de análise (colunas), são os peptídeos mais frequentes nas amostras (Figura 9). Como pode ser observado para alguns peptídeos, a alta variância dos escores indica que os peptídeos não devem ser priorizados considerando apenas um método de ranqueamento ou estatístico e destaca a importância de se estudar diferentes resultados sobre o mesmo conjunto de dados. No total, 25 peptídeos apresentaram seu valor de média acima da média de todos os peptídeos em todos os conjuntos de análises.

Figura 9. Agrupamento hierárquico dos 50% maiores pesos atribuídos aos peptídeos pelos 40 classificadores em cada uma das 14 execuções (colunas).

Outra forma de analisar esses dados e avaliar a estabilidade do mesmo é a exibição dos gráficos que representam os 50% maiores pesos de cada peptídeo. Os dados das 14 execuções foram unidos e na Figura 10 são apresentados os 14 peptídeos melhores pontuados com suas médias (centralidade) e dispersão. Como cada ranqueador atribui um peso diferente para cada peptídeo, e como em cada fold são amostras diferentes, então para cada fold, mesmo que seja o mesmo ranqueador, o peptídeo tem um peso diferente também. Sendo assim, os box-plots ajudam a verificar a estabilidade desses peptídeos.

Figura 10. Gráfico das 50% das maiores pontuações de cada peptídeo em cada ciclo (maiores 20 pontuações dos 40 conjuntos), considerando-se as proteínas que apareceram em pelo menos 33% dos conjuntos de análise.

Adicionalmente, um dos ranqueadores utilizados para avaliação da frequência também avalia a correlação entre os peptídeos entre as amostras. Portanto, quanto maior a correlação entre os peptídeos, menor será sua capacidade de separar os grupos amostrais em N+ e N0, demonstrando assim que este não seria um bom peptídeo para seleção para validação posterior.

Sco

A correlação entre os peptídeos foi avaliada de duas formas: a) a correlação entre todos os peptídeos durante os 14 conjuntos de análise e b) a correlação dos peptídeos com alta correlação na análise anterior (a). De acordo com o apresentado na Figura 11a, os peptídeos marcados em vermelho são os que apresentam maior correlação com outros peptídeos. Uma nova análise foi realizada apenas com esses peptídeos gerando novo agrupamento hierárquico (Figura 11b). Os peptídeos com peso de correlação acima de 0,90 foram excluídos da análise e se encontram descritos na Tabela 3.

Figura 11. Agrupamento hierárquico apresentando a análise de correlação de dependência entre peptídeos. Os peptídeos com valores mais próximos a 1 apresentam maior correlação entre si e foram excluídos. a) correlação entre todos os peptídeos significantes pelo método de Pearson, b) análise de correlação entre os peptídeos com ala correção na análise anterior.

Tabela 3. Peptídeos excluídos das análises após avaliação da correlação entre os peptídeos. ID da proteína Proteína Peptídeo

P03973 SLPI CLDPVDTPNPTR

P01024 CO3 VLLDGVQNLR

P13796 PLSL QFVTATDVVR

P02750 A2GL DLLLPQPDLR

P02679 FIBG YEASILTHDSSIR

Q9NUQ9 FA49B AWGAVVPLVGK

O43707 ACTN4 ACLISLGYDVENDR

P02765 FETUA FSVVYAK

P26583 HMGB2 SEHPGLSIGDTAK

A classificação das assinaturas em “boas”, “ótimas” e “melhores” é mais uma importante análise que auxilia na priorização das assinaturas de peptídeos visto que esses classificadores apresentam alta acurácia e estringência crescentes entre si.

Ao todo, então, tem-se quatro conjuntos de assinaturas: good, even better e best, e um conjunto formado por conjuntos de top-10 peptídeos de cada um dos 40 ranques nas 14 execuções. Com isso, tem-se diversas perspectivas sobre o peso dos peptídeos; sendo umas mais flexíveis que outras. Pode-se verificar então, a frequência com que tais peptídeos aparecem nesses conjuntos de assinaturas. Pela Figura 12 identifica-se facilmente a frequência com que os peptídeos foram escolhidos como bons nas diversas assinaturas. Pode-se ver também que em um grupo um peptídeo é mais frequente que em outro grupo. Escolher apenas um grupo como sendo verdade, por exemplo “good”, também seria errado. Esse tipo de abordagem fornece mais informações sobre o comportamento dos peptídeos sob diversas perspectivas de análise.

Assim, a Figura 12 apresenta a classificação de cada um dos peptídeos dentro desses 3 grupos, além da frequência dos peptídeos na lista dos top-10 ranques computados. Pode-se ver a importância da análise da classificação dos peptídeos dentro de cada um dos grupos com os exemplos dos peptídeos ILNVHVPR que embora apresente alta frequência na lista dos top-10, apresenta baixa frequência como “melhores assinatura”. Em contrapartida, o peptídeo SYNVTSVLFR apresenta baixa frequência como “boa” assinatura, mas apresenta alta frequência como “melhores” assinaturas.

Figura 12. Gráfico da frequência dos peptídeos na lista dos top-10 ranques computados, e da frequência em “boas”, “ótimas” e “melhores” assinaturas. 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 Peptídeos

Frequência na lista das top-10 e em boas, ótimas e melhores assinaturas

Frequência na lista top-10 de todos os ranques computados (14*40) Frequência Boas

Frequência Ótimas Frequência Melhores

ii e iii) A avaliação do coeficiente de variação e razão entre N+ e N0 também foram critérios de priorização para aumentar a chance de quantificação dos peptídeos na próxima etapa em um coorte independente, uma vez que sabe-se da grande variação entre abundâncias de proteínas/peptídeos na saliva pacientes observadas nesse estudo (Tabela 4) e estudos anteriores do grupo (Winck et al., 2015, Kawahara et al., 2015), foi calculado para cada um dos peptídeos e esses dados são apresentados na Tabela 4.

Tabela 4. Valores de p ajustado, razão e coeficiente de variação de todos os peptídeos diferencialmente abundantes entre pacientes N0 e N+.

Peptídeo Nome do gene Valor de p ajustado Razão N+/N0 da intensidade Coeficiente de variação em N0 (%) Coeficiente de variação em N+ (%) EGFGHLSPTGTTEFWLGNEK FIBG 0,048 7,178 175,918 202,944 NFPSPVDAAFR HEMO 0,029 5,464 158,879 223,317 YLQEIYNSNNQK FIBG 0,027 5,267 167,436 274,161 DYVSQFEGSALGK APOA1 0,027 4,947 143,477 223,018 DLATVYVDVLK APOA1 0,027 4,724 131,721 170,611 LELHVDGPPPRPQLR A1BG 0,026 4,679 142,472 243,749 LVNVVLGAHNVR PRTN3 0,050 4,246 144,289 192,971 VQPYLDDFQK APOA1 0,026 4,223 150,247 217,643 AADDTWEPFASGK TTHY 0,026 4,198 111,952 194,417 VTNGAFTGEISPGMIK TPIS 0,026 4,121 149,798 186,212 VAAGAFQGLR A2GL 0,027 3,864 181,930 206,460 SNTSPEELGPLANQLTSDYGR TLN1 0,037 3,746 145,530 170,921 SASDLTWDNLK TRFE 0,026 3,669 123,143 213,455 GLLGALTSTPYSPTQHLER FA49B 0,027 3,623 131,768 113,654 HQFLLTGDTQGR A1BG 0,027 3,620 140,452 216,996 DGAGDVAFVK TRFE 0,026 3,527 122,544 166,104 PPYTVVYFPVR GSTP1 0,041 3,284 138,114 180,256 ALPQPQNVTSLLGCTH HEMO 0,026 3,256 71,312 153,074 YNSQNQSNNQFVLYR KNG1 0,026 3,234 134,464 204,373 GSPAINVAVHVFR TTHY 0,026 3,198 78,669 122,561 YGLVTYATYPK CFAB 0,027 3,029 155,057 205,442 AYYHLLEQVAPK PLSL 0,029 3,004 136,476 115,181 WIEDTIAENS KLK1 0,026 2,973 85,465 157,615 EGMNIVEAMER PPIA 0,050 2,913 109,557 149,424 LTEPADTITDAVK KLK1 0,026 2,893 94,787 221,708 VSFELFADK PPIA 0,036 2,844 102,158 98,759 DASGVTFTWTPSSGK IGHA1 0,032 2,808 77,662 170,043 AALSYVSEIGK BPIB2 0,026 2,752 92,626 204,286 QGNAVTLGDYYQGR LSR 0,044 2,703 89,825 120,978 FEDENFILK PPIA 0,026 2,670 104,652 128,040 TVGSDTFYSFK KNG1 0,026 2,657 107,514 110,997 QADEDYSHDLMLLR KLK1 0,027 2,580 81,974 175,433 SDVVYTDWK A1AG1 0,027 2,575 161,972 189,715

AFLASPEYVNLPINGNGK GSTP1 0,026 2,472 101,717 137,132 TLDLGENQLETLPPDLLR A2GL 0,033 2,387 132,697 87,032 ETNLDSLPLVDTHSK VIME 0,026 2,355 68,153 84,776 HVFGESDELIGQK TPIS 0,027 2,317 101,054 120,364 TPLTATLSK IGHA1 0,026 2,303 114,191 253,966 IIVPLNNR IGJ 0,026 2,221 97,018 200,575 TFTCTAAYPESK IGHA1 0,027 2,160 85,935 209,482 SYNVTSVLFR NGAL 0,027 2,068 79,654 50,607 DPAFTALLTTQTQVQR CRIS3 0,033 2,004 72,480 110,711 AIGYLNTGYQR A2MG 0,027 2,001 93,405 187,123 TNFDNDIALVR C1S 0,027 1,945 104,283 234,743 VLALPEPSPAAPTLR PLEC 0,027 1,895 67,357 73,526 PTAGAFNHSDLAAELR TACD2 0,027 1,830 52,308 117,294 ITGWGEETLPDGR TINAL 0,026 1,805 60,858 124,806 QELAVFCSPEPPAK TLN1 0,026 1,703 65,308 157,128 VGDFVATDLDTGRPSTTVR DSG1 0,041 1,671 76,999 154,889 NGVAQEPVHLDSPAIK A1BG 0,026 1,652 76,465 194,964 SSSAGGQGSYVPLLR LSR 0,027 1,608 72,249 110,412 VGTDGVITVK CADH1 0,030 1,601 75,756 159,814 LNAENNATFYFK KNG1 0,026 1,436 31,134 35,138 LEPVYFVAPAK LAMC2 0,028 1,436 55,392 37,367 ILNVHVPR BPIB2 0,044 1,353 78,424 215,465 YLTAEAFGFK FSCN1 0,031 1,166 22,328 32,584 NTGVISVVTTGLDR CADH1 0,044 1,129 15,104 13,993 VTAAPQSVCALR A2MG 0,026 0,706 131,939 414,778

*Teste estatístico utilizado: Wilcoxon Mann-Whitney com valor de p <0,05 ajustado em função da razão N+/N0 da intensidade de cada um dos peptídeos.

Após a exploração de todos resultados das análises anteriormente descritas, a seleção dos peptídeos para a validação por quantificação ‘absoluta’, por proteômica baseada em alvos foi realizada (Tabela 5). Para esta seleção os critérios de inclusão foram: i) valor de p ajustado ≤0,05, ii) estar dentro dos 15 peptídeos mais frequentes na lista dos top-10 ranques (média >0,14), iii) apresentar valor de razão >1,5, iv) estar entre as “melhores” assinaturas com valor >0,15, v) possuir após os critérios acima, os menores coeficientes de variação.

Tabela 5. Análise e seleção dos peptídeos em função das avaliações de valor de p corrigido pela razão, razão N+/N0, frequência, classificação das assinaturas e coeficiente de variação entre amostras.

Peptídeo Proteína Valor de p ajustado Razão da intensidade entre N+ e N0 Frequência Assinaturas Coeficiente de variação (%) Boas Ótimas Melhores N0 N+

LNAENNATFYFK sp|P01042|KNG1_HUMAN 0,026 1,436 0,321 0,085 0,020 0,000 31,134 35,138 ETNLDSLPLVDTHSK sp|P08670|VIME_HUMAN 0,026 2,355 0,254 0,087 0,035 0,045 68,153 84,776 TVGSDTFYSFK sp|P01042|KNG1_HUMAN 0,026 2,657 0,130 0,033 0,014 0,000 107,514 110,997 GSPAINVAVHVFR sp|P02766|TTHY_HUMAN 0,026 3,198 0,361 0,153 0,138 0,125 78,669 122,561 ITGWGEETLPDGR sp|Q9GZM7|TINAL_HUMAN 0,026 1,805 0,070 0,049 0,012 0,011 60,858 124,806 FEDENFILK sp|P62937|PPIA_HUMAN 0,026 2,670 0,057 0,033 0,014 0,000 104,652 128,040 AFLASPEYVNLPINGNGK sp|P09211|GSTP1_HUMAN 0,026 2,472 0,295 0,054 0,025 0,011 101,717 137,132 ALPQPQNVTSLLGCTH sp|P02790|HEMO_HUMAN 0,026 3,256 0,514 0,373 0,691 0,920 71,312 153,074 QELAVFCSPEPPAK sp|Q9Y490|TLN1_HUMAN 0,026 1,703 0,154 0,086 0,092 0,091 65,308 157,128 WIEDTIAENS sp|P06870|KLK1_HUMAN 0,026 2,973 0,296 0,186 0,174 0,239 85,465 157,615 DGAGDVAFVK sp|P02787|TRFE_HUMAN 0,026 3,527 0,080 0,025 0,016 0,000 122,544 166,104 VTNGAFTGEISPGMIK sp|P60174|TPIS_HUMAN 0,026 4,121 0,050 0,026 0,015 0,000 149,798 186,212 AADDTWEPFASGK sp|P02766|TTHY_HUMAN 0,026 4,198 0,452 0,135 0,132 0,114 111,952 194,417 NGVAQEPVHLDSPAIK sp|P04217|A1BG_HUMAN 0,026 1,652 0,152 0,058 0,048 0,091 76,465 194,964 IIVPLNNR sp|P01591|IGJ_HUMAN 0,026 2,221 0,180 0,052 0,042 0,023 97,018 200,575 AALSYVSEIGK sp|Q8N4F0|BPIB2_HUMAN 0,026 2,752 0,311 0,151 0,112 0,091 92,626 204,286 YNSQNQSNNQFVLYR sp|P01042|KNG1_HUMAN 0,026 3,234 0,104 0,013 0,004 0,000 134,464 204,373 SASDLTWDNLK sp|P02787|TRFE_HUMAN 0,026 3,669 0,063 0,011 0,005 0,000 123,143 213,455 VQPYLDDFQK sp|P02647|APOA1_HUMAN 0,026 4,223 0,096 0,028 0,018 0,000 150,247 217,643 LTEPADTITDAVK sp|P06870|KLK1_HUMAN 0,026 2,893 0,107 0,050 0,023 0,023 94,787 221,708

SEHPGLSIGDTAK sp|P26583|HMGB2_HUMAN Peptídeo excluído pela correlação acima de 0,90 com outros peptídeos FSVVYAK sp|P02765|FETUA_HUMAN Peptídeo excluído pela correlação acima de 0,90 com outros peptídeos

LELHVDGPPPRPQLR sp|P04217|A1BG_HUMAN 0,026 4,679 0,166 0,028 0,009 0,000 142,472 243,749

TPLTATLSK sp|P01876|IGHA1_HUMAN 0,026 2,303 0,130 0,025 0,009 0,000 114,191 253,966

ACLISLGYDVENDR sp|O43707|ACTN4_HUMAN Peptídeo excluído pela correlação acima de 0,90 com outros peptídeos

DLATVYVDVLK sp|P02647|APOA1_HUMAN 0,027 4,724 0,180 0,106 0,118 0,102 131,721 170,611

QADEDYSHDLMLLR sp|P06870|KLK1_HUMAN 0,027 2,580 0,141 0,127 0,085 0,159 81,974 175,433

AIGYLNTGYQR sp|P01023|A2MG_HUMAN 0,027 2,001 0,091 0,019 0,008 0,011 93,405 187,123

SDVVYTDWK sp|P02763|A1AG1_HUMAN 0,027 2,575 0,088 0,026 0,009 0,000 161,972 189,715

QFVTATDVVR sp|P13796|PLSL_HUMAN Peptídeo excluído pela correlação acima de 0,90 com outros peptídeos

YGLVTYATYPK sp|P00751|CFAB_HUMAN 0,027 3,029 0,145 0,022 0,013 0,000 155,057 205,442 VAAGAFQGLR sp|P02750|A2GL_HUMAN 0,027 3,864 0,052 0,028 0,016 0,000 181,930 206,460 TFTCTAAYPESK sp|P01876|IGHA1_HUMAN 0,027 2,160 0,239 0,093 0,076 0,080 85,935 209,482 HQFLLTGDTQGR sp|P04217|A1BG_HUMAN 0,027 3,620 0,098 0,014 0,005 0,000 140,452 216,996 DYVSQFEGSALGK sp|P02647|APOA1_HUMAN 0,027 4,947 0,059 0,035 0,022 0,023 143,477 223,018 TNFDNDIALVR sp|P09871|C1S_HUMAN 0,027 1,945 0,054 0,014 0,012 0,011 104,283 234,743 YLQEIYNSNNQK sp|P02679|FIBG_HUMAN 0,027 5,267 0,036 0,009 0,003 0,000 167,436 274,161 LEPVYFVAPAK sp|Q13753|LAMC2_HUMAN 0,028 1,436 0,268 0,594 0,850 0,909 55,392 37,367 NFPSPVDAAFR sp|P02790|HEMO_HUMAN 0,029 5,464 0,084 0,028 0,018 0,011 158,879 223,317 AYYHLLEQVAPK sp|P13796|PLSL_HUMAN 0,029 3,004 0,032 0,025 0,012 0,011 136,476 115,181 VGTDGVITVK sp|P12830|CADH1_HUMAN 0,030 1,601 0,070 0,040 0,028 0,045 75,756 159,814 YLTAEAFGFK sp|Q16658|FSCN1_HUMAN 0,031 1,166 0,163 0,111 0,177 0,398 22,328 32,584 DASGVTFTWTPSSGK sp|P01876|IGHA1_HUMAN 0,032 2,808 0,123 0,130 0,080 0,091 77,662 170,043 TLDLGENQLETLPPDLLR sp|P02750|A2GL_HUMAN 0,033 2,387 0,213 0,063 0,042 0,034 132,697 87,032 DPAFTALLTTQTQVQR sp|P54108|CRIS3_HUMAN 0,033 2,004 0,055 0,077 0,042 0,034 72,480 110,711 AWGAVVPLVGK sp|Q9NUQ9|FA49B_HUMAN Peptídeo excluído pela correlação acima de 0,90 com outros peptídeos

VLLDGVQNLR sp|P01024|CO3_HUMAN Peptídeo excluído pela correlação acima de 0,90 com outros peptídeos

SNTSPEELGPLANQLTSDYGR sp|Q9Y490|TLN1_HUMAN 0,037 3,746 0,061 0,039 0,017 0,000 145,530 170,921 DLLLPQPDLR sp|P02750|A2GL_HUMAN Peptídeo excluído pela correlação acima de 0,90 com outros peptídeos

VGDFVATDLDTGRPSTTVR sp|Q02413|DSG1_HUMAN 0,041 1,671 0,246 0,100 0,085 0,068 76,999 154,889

PPYTVVYFPVR sp|P09211|GSTP1_HUMAN 0,041 3,284 0,121 0,039 0,034 0,011 138,114 180,256

ILNVHVPR sp|Q8N4F0|BPIB2_HUMAN 0,044 1,353 0,430 0,218 0,245 0,114 78,424 215,465

NTGVISVVTTGLDR sp|P12830|CADH1_HUMAN 0,044 1,129 0,123 0,052 0,035 0,057 15,104 13,993

QGNAVTLGDYYQGR sp|Q86X29|LSR_HUMAN 0,044 2,703 0,446 0,357 0,485 0,455 89,825 120,978

No documento Verificação de proteínas da saliva candidatas a marcadores em CEC e sua correlação com o prognóstico (páginas 50-93)