Quimiocinas são famílias de proteínas estruturalmente relacionadas que compartilham a capacidade de induzir quimiotaxia. Ou seja, migração de linhagens específicas de leucócitos com importância na especificidade entre mononucleares ou polinucleares, estabelecendo, assim, diferenciação na atração e ativação leucocitárias de maneira seletiva. Estas citocinas especializadas desempenham um papel crítico na geração da inflamação celular em situações como resposta na proteção contra patógenos invasores e processos patológicos associados à infecção ou a doenças imunes. Quimiocinas são mais que simples fatores quimiotáticos, elas também estão implicadas na ativação e no controle do tráfico leucocitário, angiogênese e função antimicrobiana incluindo uma condição protetora contra a infecção do vírus da imunodeficiência humana adquirida (HIV) (Adams e Lloyd, 1997; Rollins, 1997). A expressão aumentada de RANTES está associada à ampla variedade de processos inflamatórios como rejeição de transplantes, aterosclerose, artrite, dermatites atópicas, atopias respiratórias como asma, reações de hipersensibilidade tardia, glomerulonefrite, endometriose, Doença de Alzheimer e certos tumores malignos (Appay e Rowland-Jones, 2001; Saad-El-Din Bessa et al, 2012).
Quimiocina, do ponto de vista bioquímico (Adams e Lloyd, 1997), estabelece RANTES como uma pequena proteína composta por 68 aminoácidos, com baixo peso molecular - 8 à 12 kD (Rollins, 1997). Os domínios das quimiocinas, responsáveis pela especificidade da ação biológica, são definidos pela presença de quatro resíduos de cisteína em posições fortemente conservadas. Uma das principais famílias de quimiocinas a ―CXC‖ ou -quimiocina possui um resíduo de aminoácido entre dois resíduos de cisteína na porção amino terminal; a outra grande família de quimiocinas é a ―CC‖ ou β-quimiocina que não possui aminoácido entre os
resíduos de cisteína adjacentes, conforme esquematizado na Figura 1 adaptada de Adams & Lloyd, 1997 (Adams e Lloyd, 1997; Rollins, 1997).
Figura 1 - Protótipos Estruturais de Quimiocinas e Adaptado de Adams & Lloyd (1997).
A secreção de quimiocinas é induzida por citocinas inflamatórias Th1 como IL-1, IL-2, TNF- e produtos bacterianos de lipopolissacarideos (LPL) e a inibição da produção e liberação de quimiocinas pode ser creditada à ação de citocinas Th2
-Quimiocina
como IL-4 e IL-10 (Adams e Lloyd, 1997). A capacidade das quimiocinas de promoverem migração leucocitária é, provavelmente, sua mais importante função biológica. As quimiocinas contribuem para o recrutamento leucocitário primeiramente por integrinas ativadas (moléculas expressadas por leucócitos que mediam a adesão para células endoteliais e proteínas da matriz extracelular) e, secundariamente por promover migração dos leucócitos aderidos ao endotélio, através da matriz extracelular em um processo conhecido como haptotaxia (Springer, 1994; Adams e Lloyd, 1997).
A composição celular e a duração da resposta inflamatória dependem da natureza do estímulo seguido e do microambiente no qual ele ocorre. Neutrófilos mediam uma resposta aguda, rápida para infecção ou tecido lesado. Ao contrário, monócitos e linfócitos são tipicamente recrutados durante a inflamação crônica, como na resposta de hipersensibilidade tardia. O recrutamento de eosinófilos é um feito relevante das respostas alérgicas e parasitoses (Ebnet et al, 1996; Adams e Lloyd, 1997). Além do recrutamento de leucócitos para o local da inflamação, quimiocinas são também importantes reguladores da ativação leucocitária. As quimiocinas ―CC‖ possuem um amplo espectro de ação com atração de linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos, e células NK, participando da regulação de linfócitos, processo inflamatório, hematopoiese, imunidade antitumoral e em alguns casos proteção contra a infecção pelo HIV (Rollins, 1997).
Assim como a IL-8 é considerada a quimiocina protótipo da família ―CXC‖ na quimiotaxia, sobretudo na atração de polinucleares como neutrófilos, a Proteína Quimioatraente de Monócitos 1 (MCP-1) é considerada o protótipo da família ―CC‖ na ação biológica, atraindo mononucleares e também eosinófilos e basófilos (Rollins,
1997). MCP-1 foi inicialmente purificada de células musculares lisas da porção medial da artéria aorta de babuínos (Valente et al, 1988).
RANTES, molécula isolada por Schall e colaboradores em 1988 numa triagem diferencial entre células B e T, é considerada uma quimiocina ―CC‖. Compartilha ação de quimiotaxia com a MCP-1, sendo a exocitose a diferença entre estas duas moléculas, pois na liberação de RANTES este fenômeno é bem menos estimulado (Schall et al, 1988). Sua principal ação fisiológica é atrair e recrutar linfócitos T de memória CD45RO+ (CD45RO) e Linfócitos T Auxiliar CD4+ (CD 4) em células endoteliais e no sistema transendotelial. Além de CD4 atrai também Linfócitos Supressores CD8+ (CD 8) sendo considerada a molécula de ação quimiotáxica mais potente para células CD8+. Age como um ativador, independente de antígeno, das células T mediante respostas celulares como abertura dos canais de cálcio e liberação de citocinas (Roth et al, 1995; Rollins, 1997).
As quimiocinas podem ligar-se aos proteoglicanos no glicocálice endotelial, envolvendo-os para agir como ligantes imobilizados na parede vascular localizada nos locais de inflamação sem serem arrastados pelo fluxo da corrente sanguínea (Ebnet et al, 1996). A afinidade de quimiocinas por proteoglicanos em particular pode variar entre tecidos distintos e durante a inflamação (Ebnet et al, 1996). RANTES está envolvido no processo de apoptose com a despolarização celular induzida pelo influxo prolongado de cálcio (Ca++) e liberação de citocinas inflamatórias promotoras de adesão/agregação celular, especialmente através de proteoglicanos também conhecidos como glicosaminoglicanos (GACs) (Appay e Rowland-Jones, 2001). O complexo da ligação dos GACs com quimiocinas é um pré-requisito para a ligação das quimiocinas com seus receptores e a interação quimiocina/GACs potencializa a atividade de citocinas quimiotáticas (Rek et al,
2009). De acordo com Rollins (1997), os cinco diferentes tipos de receptores específicos para quimiocinas do tipo ―CC‖ mostram especificidade cruzada para as citocinas, sendo exceção a eotaxina que se liga somente ao receptor CCR3 e MIP- 1 que por sua vez liga-se ao receptor CCR5. Apesar do receptor CCR3 ligar-se à RANTES com alta afinidade, o receptor CCR5 é que apresenta a maior afinidade, além da alta afinidade também com MIP-1 e MIP-1β (Gao et al, 1993; Neote et al, 1993). Além destes, os receptores CCR1 e CCR4 também podem ligar-se (Appay e Rowland-Jones, 2001).
Os efeitos de RANTES podem ser separados em dois grupos de acordo com sua concentração conforme Figura 2 adaptada de Appay & Roland-Jones (2001). Em baixas concentrações, a molécula atua, na forma monomérica ou dimérica sobre seus receptores específicos CCR1, CCR3, CCR4 e CCR5 promovendo quimiotaxia, mobilização transitória de cálcio e supressão da infecção do HIV através da alta afinidade da ligação com estes tipos de receptores (Appay e Rowland-Jones, 2001; Rek et al, 2009). Além de RANTES, MIP-1α e MIP-1β são as outras quimiocinas ―CC‖ capazes de inibir a entrada do vírus HIV nos macrófagos pela competição com os receptores CCR, diminuindo a infectividade do HIV (Hariharan et al, 2000).
Fonte: Adaptado de Appay & Roland-Jones (2001).
Figura 2 - Influência da concentração de RANTES na ligação celular.
Aumento da citotoxicidade Quimiotaxia Supressão da infecção pelo HIV Aumento da infecção pelo HIV? Monômero/Dímero Multímero/polímero Baixa Concentração Alta Concentração Ativação Leucocitária Aumento da infecção peloHIV
Em altas concentrações, RANTES promove autoagregação formando multímeros/oligômeros (agregados) e atua através de interação seletiva com GACs na superfície celular (Appay e Rowland-Jones, 2001; Mbemba et al, 2001; Proudfoot et al, 2001; Rek et al, 2009). Esta situação induz diminuição da afinidade da proteína tirosina quinase, sinalizando uma via celular que leva à ativação e proliferação de células T (Rek et al, 2009). RANTES promove a indução da expressão da IL-2, agregação homotípica e expressão aumentada de moléculas de superfície celular como os receptores de IL-2 (Rek et al, 2009). De fato, a expressão aumentada de GACs durante a inflamação é sugerida por Rek e colaboradores (2009) para interagir com as altas taxas de quimiocinas disponibilizadas estabelecendo gradiente para uma resposta inflamatória.
A agregação é um pré-requisito para a atividade biológica inflamatória de RANTES, pois a sua oligomerização e a ligação com GACs é necessária para a atividade quimiotática ―in vivo‖ (Proudfoot et al, 2003). A migração leucocitária induzida pelo RANTES deve-se à ligação desta quimiocina com os receptores acoplados a Proteína-G transmembrana-7, pois a molécula liga-se ao endotélio ativado promovendo a migração celular por haptotaxia, sugerindo desta maneira uma ação bem definida nos processos inflamatórios (Wiedermann et al, 1993; Von Luettichau et al, 1996). A afinidade pelos GACs é dependente de interações eletrostáticas e ligações de hidrogênio, as quais contribuem significativamente para a ligação de alta afinidade da molécula por estes tipos de receptores (Rek et al, 2009). A interação GAC/RANTES produz uma mudança na forma da quimiocina induzindo e facilitando a formação dos oligômeros como pré-requisito para a ativação leucocitária (Rek et al, 2009). Deste modo, a quimiocina atua como um modulador imunológico na forma agregada (Rek et al, 2009). As variações não
agregadas de RANTES (monômeros ou dímeros) têm pouco ou nenhum efeito na ativação leucocitária (Appay et al, 1999).
Os principais membros da família dos GACs são os oligossacarídeos heparina e sulfato de heparan, consistindo de uma cadeia linear de 20-100 unidades de dissacarídeos, compostos de N-Acetil-D-glicosamina e ácido D-glicurônico, os quais podem ser modificados para incluir uma sulfatação de Nitrogênio ou Oxigênio além da epimerização do ácido β-D-glicurônico para ácido α-D-glicurônico. (Mbemba et al, 2001). O aumento da expressão e da quimiotaxia de RANTES em doenças do tecido reprodutivo, sobretudo na endometriose, está bem documentada (Hornung et al, 2001; Kalu et al, 2007; Chun-Li F, 2009).
A PE é considerada a síndrome de várias teorias e RANTES pode ter um papel importante nas duas mais aceitas, ou seja, teoria da má adaptação imune materno-fetal e a teoria inflamatória (Xia & Kellems, 2009; Sibai et al, 2005; Redman et al, 1999; Dekker & Sibai, 1998). A teoria da má adaptação imune materno-fetal pode ser a principal causa da placentação superficial e consequente estimulo inflamatório materno com ativação Th1 (Sibai et al, 2005). A subpopulação leucocitária é uma característica primária intrínseca da decídua uterina, independente da gestação e as células NK estão sobre efeito da regulação hormonal em roedores e humanos, aumentando na fase lútea pós ovulatória e predominando até o terceiro trimestre da gestação (King et al, 1997). Além disso, estudos imunohistoquímicos demonstram que 30-40% das células estromais da decídua humana, no início da gestação, são leucócitos, sendo que mais de 70% desses leucócitos deciduais são células NK CD56 (Bulmer et al, 1991; Moffett-King, 2002).
Durante o início da gestação células NK uterinas acumulam como um infiltrado denso envolvendo as células trofoblásticas invasoras (Croy et al, 2003, van
der Meer et al, 2004). Da metade da gestação em diante, estas células NK uterinas progressivamente desaparecem, o que coincide com a invasão citotrofoblastica, em que a placentação humana se completa ao redor da 20ª semana de gestação (Sibai et al, 2005). Células NK uterinas afetam ambas, invasão trofoblástica e a modificação das artérias espiraladas uterinas através da produção de citocinas que estão implicadas na angiogênese e estabilidade vascular (Sibai et al, 2005; van der Meer, 2004; Croy et al, 2003). Um dos principais produtos das células NK é a produção de IFN-, que fisiologicamente é essencial na modificação das artérias espiraladas uterinas (Croy et al, 2003).
Von Rango e colaboradores (2001) associando os efeitos da invasão trofoblástica com subpopulações leucocitárias no útero e nas trompas de Falópio mostraram que a grande quantidade de células NK inibe a implantação, inclusive especulando que o alto grau de invasão trofoblástica na parede tubária durante a gravidez ectópica pode estar associado à ausência de células NK nesse tecido. Células CD 8 e macrófagos CD 68 também mostraram uma forte associação com células trofoblásticas (Von Rango et al, 2001). Células NK são linfócitos do sistema imune inato, envolvidas na defesa precoce contra células estranhas, agentes infecciosos e células tumorais (Croy et al, 2003; Moretta e Moretta, 2004; Terme, 2005). Quando ativadas exercem ação citotóxica induzindo apoptose em células alvos, com liberação de grande quantidade de citocinas como IFN- ,TNF-, e GM- CSF, além das quimiocinas MIP-1,MIP-1 e RANTES (Moretta e Moretta, 2004; Terme, 2005).
Além disso, há estudos prévios relatando o fato da PE, principalmente a precoce, estar associada à diminuída placentação ocasionada pela pobre invasão trofoblástica nas artérias uterinas espiraladas, sendo as células NK, sobretudo a
subpopulação e CD56bright e linfócitos CD8+ relevantes para o processo de implantação e, consequentemente, cruciais para a placentação normal (King et al, 1997; Von Rango et al, 2001; Terme, 2005; Scaife et al, 2006; Williams et al, 2009).
RANTES também estimula a atividade citotóxica de células CD8+ e células NK (Taub et al, 1996). RANTES e MIP-1α aumentam a proliferação de células T devido ao aumento da expressão B7 nas células apresentadoras de antígenos e também por aumentar a produção de IL-2 de células T ativadas (Bacon et al, 1995).De particular importância é o fato de IL-2 e IL-12 ativarem e estimularem as células NK a promoverem a morte de células trofoblásticas no primeiro trimestre de gestação, pois estas células, juntamente com linfócitos T reconhecem a invasão trofoblástica promovendo apoptose para prevenir a superinvasão de células fetais (King et al, 1997; Von Rango et al, 2001; Terme, 2005; Scaife et al, 2006; Williams et al, 2009). A produção de IL-2 leva à produção de IFN- pelas células NK aumentando a sua toxicidade. IL-2 e IFN-detectados na decídua são secretados por células T e NK ativadas, as quais se encontram presentes neste local durante o início da gravidez humana (Scaife et al, 2006; Williams et al, 2009). O estudo de RANTES adquire relevância pelo fato de a pobre placentação, feito comum na PE, estar associada a células NK, CD8+ e macrófagos CD 68+, todas elas alvos primários desta quimiocina, através da quimiotaxia, liberação de IL-2 e ativação leucocitária. Além disso, estas células estimuladas e ativadas secretam citocinas que possuem um alto grau de envolvimento na síntese e na liberação da quimiocina estudada nesta tese.
De fato, várias citocinas inflamatórias estão documentadas na PE como TNF-, IL1-, IL1-β, IL-6 e IL-8, sendo algumas delas relacionadas diretamente na síntese e liberação de RANTES (Dekker e Sibai, 1998; Redman et al, 1999; Benyo
et al, 2001; Jonsson et al, 2006; Mutter e Karumanchi, 2008). Em todas estas patologias citadas, esta proteína atua promovendo infiltração leucocitária para os locais de inflamação.
Há também estudos sobre ação quimiotática de RANTES em linfócitos T na inflamação, associando o recrutamento de dessas células ao local inflamado em patologias distintas como endometriose ou lúpus eritematoso sistêmico. Inclusive associa a expressão dessa molécula com osmarcadores de atividade inflamatória do lúpus (C3, C4, ANA, Anticorpos anti-ds-DNA, Anti-corpos anti-Sm, Anti-corpos anti- SSB e IgG) e com a severidade da endometriose, neste caso pela detecção de monócitos nas células endometriais (Hornung et al, 2001; Lu et al, 2012). Vale ressaltar que a expressão do mRNA de RANTES pode ser inibida por corticosteroides (Wingettr et al, 1996).
A produção de RANTES, a qual é gerada predominantemente por linfócitos T CD8+, e também por células endoteliais, células epiteliais, fibroblastos e plaquetas, é um fato importante na inflamação (Appay e Rowland-Jones, 2001). A interação das citocinas TNF- e IFN- possui um efeito sinérgico na produção de RANTES nas células endoteliais e nos fibroblastos evidenciando que a combinação destas duas citocinas Th1 seja um fator determinante para a regulação da sua produção pelo aumento de mRNA desta quimiocina (Marfaing-Koka et al, 1995).
Mais recentemente, Nakada e colaboradores (2009) mostraram que a produção intracelular aumentada de RANTES induzida pela expressão de mRNA lipossomal nas células trofoblásticas foi via dependente dos receptores tipo –Toll ―Toll-like receptor 3‖ (TLR3), através de encapsulação dos lipídios de membrana. Sugerindo à molécula quimioatraente também um papel na sinalização celular da inflamação, pois TLR3 induz os marcadores celulares da inflamação como o
aumento da produção e da ativação intracelular do marcador NF-к, além do aumento da síntese de RANTES. Embora células do estroma endometrial não secretem RANTES sob condições basais, a associação entre TNF- e IFN- ambas citocinas aumentadas na PE, induziram a expressão ―in vitro‖ de mRNA da própria quimiocina neste tecido (Hornung et al, 2001).
A indução por TNF- e IFN- foi relatada em outras células também, pois IFN- estimula a expressão em macrófagos (Devergne et al, 1994) enquanto TNF-α estimula a expressão de RANTES em fibroblastos, células mesangiais e células do epitélio tubular renal (Heeger et al, 1992; Rathanaswami et al, 1993; Pattison et al, 1994). O sinergismo entre TNF- e IFN- tem sido descrito também em vários fenômenos associados à inflamação incluindo a atividade citotóxica de macrófagos, a produção de radicais livres, sobretudo espécies reativas de oxigênio, a produção de óxido nítrico e a expressão de moléculas de adesão (Feinman et al, 1987; Liew et al, 1990; Kamijo et al, 1993). Importante salientar que a produção de RANTES estimulada pelo sinergismo produzido pela ação conjunta das citocinas Th1 TNF-α e IFN- foi parcial e significativamente inibida pelas citocinas Th2 IL-4 e IL-13 (Marfaing-Koka et al, 1995). A maioria dos tecidos normais de pacientes adultos apresenta pouca ou nenhuma célula positiva para expressão de RANTES, assim como a maioria dos tumores e leucemias testadas por von Luettichau e colaboradores (1996). A expressão aumenta nos locais de inflamação, sendo importante salientar os altos níveis expressos de mRNA e da própria quimiocina/proteína RANTES em megacariócitos, alguns tumores e alguns tecidos fetais, sobretudo nos megacariócitos no baço fetal de fetos de 22 semanas (Von Luettichau et al, 1996).
Em tecidos fetais, células glomerulares, ocasionalmente expressaram RANTES, mas nas células dos túbulos proximais e no córtex renal a expressão é acentuada. Em geral, raras células durante o desenvolvimento fetal expressam RANTES, sendo exceção os megacariócitos no baço na hematopoiese extramedular e células mesangiais durante o desenvolvimento renal, com altos índices desta quimiocina no mesangio glomerular e nos túbulos proximais, o que sugere uma importância na organogênese renal, além da ação quimiotática para esta molécula (Von Luettichau et al, 1996).
Infiltrado de células mononucleares é um dos marcadores de rejeição de transplantes de órgãos. RANTES está presente no infiltrado de células mononucleares do interstício, produzido pelas células epiteliais renais durante a rejeição de transplante renal, sendo sintetizado localmente no interior do local inflamado ligado ao endotélio ativado capaz de atrair monócitos por haptotaxia (Wiedermann et al, 1993). Apesar de a lesão renal (endoteliose glomerular) ser uma manifestação clínica característica da SPE e, além disso, haver uma associação importante de RANTES neste tecido em situações distintas como organogênese na fase fetal e rejeição em transplantes na fase adulta (Wiedermann et al, 1993; Von Luettichau et al, 1996), há uma carência de publicações sobre esta molécula na PE e gestação normal.
Athayde e colaboradores (1999) em um dos raros trabalhos sobre esta molécula na gestação procurou estabelecer uma relação entre sua concentração no liquido amniótico e a idade gestacional. Encontraram uma diminuição da concentração desta quimiocina no líquido amniótico com o avanço da idade gestacional, estando, portanto, aumentada em pacientes com parto prematuro quando comparado com pacientes a termo (Athayde et al, 1999). A concentração de
RANTES também está aumentada no liquido amniótico durante o trabalho de parto e infecção bacteriana da cavidade amniótica induzida por endotoxinas bacterianas, fato que promove a quimiotaxia de monócitos e linfócitos (Athayde et al, 1999). Outras citocinas Th1 como TNF- e IL-1β também estão aumentadas durante a prematuridade do trabalho de parto ou nascimento (Matoba et al., 2009). Jonsson e colaboradores (2006) realizaram um mapeamento sérico de 22 citocinas, incluindo RANTES, em grupos de gestantes normais e com PE, relatando diferenças entre os grupos apenas nas concentrações de IL-6, IL-8 e receptor solúvel de IL-4. Hwang e colaboradores (2010) também não encontraram diferença nesta molécula entre gestantes normais e com PE, estudando a expressão de algumas dezenas de citocinas em células embrionárias mesenquimais placentárias.
Hariharan e colaboradores (2000), ao estudarem quimiocina ―CC‖ em mononucleares, mostraram uma diminuição da expressão intracelular de RANTES em linfócitos do cordão umbilical em relação aos linfócitos do sangue periférico de adultos e produção pelas células mononucleares no cordão umbilical. Esta última devendo-se principalmente aos linfócitos CD8+/CD45RO (Hariharan et al, 2000). Além do alto coeficiente de correlação estabelecido entre as citocinas Th1, MCP-1, MIP-1β e IL-8 no cordão umbilical, os resultados de Takahashi e colaboradores (2010) mostraram no cordão umbilical que esta quimiocina possui níveis mais elevados que as outras 14 citocinas estudadas.
Há um grande número de publicações sugerindo um caráter aterogênico de RANTES pela indução da migração leucocitária transendotelial, implicado nas fases iniciais da parte inflamatória do processo aterogênico (Simeoni et al, 2004). Tem sido proposto que quando estocado nas vesículas secretoras plaquetárias é liberado diante da ativação plaquetária e imobilizado na superfície do endotélio inflamado,
promovendo recrutamento de monócitos, aderindo-os às artérias ateroscleróticas e acelerando a formação dessas lesões assim como a formação de trombo (Von Hundelshausen et al, 2001; Huo et al, 2003). Há também estudos experimentais em