Esquema 30 – RCE do álcool racêmico 116.
Para estes experimentos, as CAL-B imobilizada em resina e lipases não imobilizadas como PCL-G, A12L-A, AE07 e A2AE011 foram investigadas (Tabela 5).
Tabela 5. Triagem de lipases. Condições: 116 (0.1 mmol), lipase (10 mg) [5 mg/mL], acetato de vinila (0.1 mL),
n-hexano (2.0 mL), 150 rpm, 25 °C.
Entrada Lipase (S)-116 (ee%)b (R)-117 (ee%)b Tempo (min) C (%) E
1 CALB > 99 > 99 15 50 > 200 2 A12L-A 48 73 15 40 10 3 AE07 > 99 > 99 60 50 > 200 4 A2AE011 96 97 120 50 > 200 5 PCL-G 7 > 99 15 6,5 < 5 a
CAL-B.: lipase B from candida antarctica; A12L-A.: Lipase A amano 12; AE07.: lipase from Pseudomonas stutzeri; A2AE011.: lipase from
Alcaligenes spp. PCL-G.: lipase G from Penicillium camenberti. b A determinação da configuração absoluta será discutida na sessão 3.1.2.5.
A partir da Tabela 5, é possível observar que dentre todas as lipases testadas, três delas mostraram ser eficientes catalisadores frente ao álcool racêmico 116, apresentando conversão (C = 50%) e razão enantiomérica (E > 200) excelentes (Tabela 5 - Entradas 1, 3 e 4).
Em relação ao excesso enantiomérico e o tempo dos experimentos de resolução enzimática, os resultados apresentados na Tabela 5 mostram que as lipases CAL-B (Tabela 5 - Entrada 1) e AE07 (Tabela 5 - Entrada 3) apresentaram melhores resultados frente ao substrato racêmico 116 quando comparado com a lipase A2AE011 (Tabela 5 - Entrada 4). Embora as reações empregando ambas lipases CAL-B e AE07 tenham mostrado mesma conversão e razão enantiomérica frente ao álcool 116, a velocidade de conversão se mostrou 4 vezes maior quando CAL-B foi usada como catalisador (Tabela 5, Entradas 1 e 3). Neste caso, a esterificação estereosseletiva catalisada por CAL-B precisou de 15 minutos para ser finalizada, à temperatura ambiente. Vale destacar que enzimas como lipase A from Aspergillus Niger (ANL-A), lipase M from MucorJavarocus (MJL-M), lipase from Candida rugose (CRL), lipase G amano 50 (A50L-G), e lipase Pseudomonas stutzeri from Mucor (PSM) apresentaram baixa enantioprefrência e desta forma foram dispensadas na triagem inicial. Sendo assim, a lipase
CAL-B foi escolhida como catalisador padrão nos estudos seguintes frente às triagens de temperatura e solvente.
3.1.2.2 Triagem de temperatura
Sabendo que a temperatura pode influenciar na velocidade de uma reação química catalisada por enzimas, uma triagem de temperatura foi realizada com o objetivo de refinar as condições dos experimentos de resolução cinética enzimática. Nesse sentido, as reações catalisadas por lipase empregando CAL-B frente ao álcool racêmico 116 foram realizadas variando a temperatura de 25 °C até 50 °C. Como pode ser visto na Figura 11, o efeito da temperatura na velocidade da reação de acilação catalisada por CAL-B apresentou comportamento similar em diferentes temperaturas acima de 15 minutos de reação.
Figura 11 – Triagem de temperatura.71
Os resultados deste estudo mostraram que quando a temperatura é aumentada a partir de 25 °C para 35 °C, a conversão torna-se 33% mais rápida levando à formação do éster (R)- 117 com excesso enantiomérico de 99%, em apenas 10 min de reação.
71 Figura tirada do trabalho: Ferreira, D. S. P. et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2016, 126, 37- 45.
A Figura 12 apresenta o monitoramento cromatográfico da esterificação do álcool racêmico 116 catalisada por CAL-B, à temperatura de 35 °C.
Figura 12 – Monitoramento reacional.71
Após otimização das condições de análise e resolução cinética enzimática, os compostos (S)-116 e (R)-117 foram obtidos em excessos enantioméricos acima de 99.9%.
3.1.2.3 Efeito do co-solvente e reciclo de catalisador
Recentemente nosso grupo estudou o efeito do co-solvente na atividade da CAL-B usando n-hexano como solvente.72 Baseados neste trabalho, um estudo da resolução enzimática
foi realizado em escala analítica para avaliar a habilidade da CAL-B em catalisar uma reação de acilação assimétrica frente ao álcool racêmico 116, na presença de THF como co-solvente, em diferentes proporções (Tabela 6).
Tabela 6. Efeito do co-solvente. Condições: 116 (0.1 mmol), lipase (10 mg) [5 mg/mL], acetato de vinila (0.1 mL), n-hexano (2.0 mL), 150 rpm, 35 °C.
Entrada Solvente (S)-116 (ee) (R)-117 (ee) Tempo (min) C (%)
1 n-hexano 99% 99% 15 50
2 n-hexano/THF* 99% 99% 60 50
3 THF 98% 99% 120 49
* n-hexano/THF em proporção de 1:1.
Analisando os resultados da Tabela 6, foi possível observar que aumentando a quantidade de THF a reação torna-se mais lenta, embora ainda mantenha excelentes excessos enantioméricos. Quando a proporção de n-hexano/THF são iguais, a CAL-B levou 1h para converter o substrato (Tabela 6 - Entrada 2). No caso em que se empregou THF puro como solvente, 2h de reação foram necessárias para obter a mesma conversão (Tabel 6 - Entrada 3). Dessa forma, o tempo de reação para ambos os casos foi 4 e 8 vezes maior, respectivamente, se comparado quando n-hexano foi utilizado como único solvente de reação. Estas observações mostram que a atividade enzimática diminui à medida que a proporção de THF aumenta. Devido sua alta polaridade (quando comparado com n-hexano), a presença de THF no sistema diminui o efeito hidrofóbico sobre a enzima. Dessa forma, a configuração inicial enzimática do tipo “tampa aberta” deve sofrer alterações na presença de THF como co-solvente, fazendo com que o sítio ativo passe a ser menos disponível para o substrato (configuração do tipo “tampa fechada”).47
Como a CAL-B apresentou alta eficiência nos experimentos anteriores, investigou-se o efeito de rotatividade enzimática, tendo em vista que o efeito catalítico da enzima poderia ser modificado de acordo com sua reutilização. Dessa forma, a conversão e seletividade enzimática frente ao substrato racêmico 116 foram analisadas (Gráfico 1).
Gráfico 1 – Estudo de rotatividade enzimática.
Os resultados deste estudo mostraram significante perda de atividade enzimática após 7 ciclos.
3.1.2.4 Concentração de doador de acila
De forma a ajustar todos os parâmetros reacionais, verificou-se a influência da quantidade de doador de acila na resolução enzimática do substrato modelo, em escala preparativa. Nesse sentido, experimentos utilizando 1.25, 5 e 10 equivalentes de acetato de vinila foram realizados de acordo com a Tabela 7.
Tabela 7. Variação de acetato de vinila. Condições: 116 (1 mmol), lipase [5 mg/mL], acetato de vinila, n-hexano (20 mL), 150 rpm, 35 °C.
Entrada Acetato de vinila (eq)
(S)-116 (ee) (R)-117 (ee) Tempo (min) C (%)
1 1.25 99% 99% 10 50
2 5 99% 99% 10 50
3 10 99% 99% 10 50
Como pode ser observado a partir da Tabela 7, excelente conversão (C = 50%) foi obtida para todos os casos (Tabela 7 - Entradas 1, 2 e 3). Nesta escala, a variação da concentração de doador de acila no intervalo dado não exerceu influência no tempo reacional. Com isso, definiu- se como a quantidade de acetato de vinila a ser utilizada nos experimentos de resolução enzimática catalisada por CAL-B como sendo de 1.25 equivalentes.
3.1.2.5 Determinação da configuração absoluta do álcool 4-(furan-2-il)butan-2-ol
Para determinar a enantiopreferência da CAL-B frente ao álcool racêmico 116, esta reação teve a escala aumentada de 0.1 mmol para 1 mmol. Assim, após a resolução cinética enzimática os compostos 116 e 117 foram isolados por cromatografia em sílica gel como fase estacionária e ambos foram caracterizados. Dessa forma determinou-se a enantiopreferência da CAL-B através da comparação dos valores de rotação ótica obtidos para cada um destes compostos com os valores correspondentes descritos na literatura. Para o enantiômero não reativo (S)-116, foi obtido uma rotação ótica de [α]D20 = − 23.9 (c 1.0 in CHCl3), correspondente
a um excesso enantiomérico de 99%. Por outro lado, rotação ótica de [α]D20 = − 14.4 (c 1.2 em
CHCl3) correspondente a ee 74% é descrita na literatura para o álcool (S)-116 (Esquema 31).
Esquema 31 – Atribuição de configuração absoluta do álcool (S)-116.