REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE TIPO PCR SIMPLES E NESTED PCR

As condições das reações seguiram o metodo clássico da Reação em Cadeia da Polimerase e da nested-PCR ou dupla PCR. Foi utilizado o GoTaq Green Master Mix, 2X (Promega Corporation, Madison-WI, EUA): GoTaq DNA Polymerase, contendo um tampão 2X (pH 8.5), 400µM dATP, 400µM dGTP, 400µM dCTP, 400µM dTTP e 3mM MgCl2. Green GoTaq Tampão de Reação é um tampão que contém um componente que aumenta a densidade da amostra e corantes azuis e amarelos, ao qual a função é carregamento do corante quando o produto da reação é analisado através do gel de agarose por eletroforese.

4.7.1 PCR PARA DETECÇÃO DO GENE DA BETA 2-MICROGLOBULINA HUMANA

A amplificação de um fragmento do gene da Beta 2 - Microglobulina (ß2 Microglobulina) humana foi utilizada para checar a qualidade do DNA em todas as amostras extraídas testadas. O produto obtido de 102 pares de bases, e indicou principalmente a presença de DNA nas amostras e que o DNA extraído é de boa qualidade, não contendo substâncias inibidoras da reação, garantindo, um controle interno de qualidade do experimento, indispensável à segurança dos resultados.

A reação de amplificação foi do tipo PCR simples, e foram realizados 35 ciclos de amplificação para cada amostra e cada um deles compreendeu: separação de hélices de DNA (aquecimento a 94º durante 30 seg); ligação complementar entre os primers e o DNA (temperatura de 55ºC por 30 seg); extensão dos primers por ação da Taq DNA polimerase (72º durante 30 seg). Um ciclo inicial de 94ºC por 4 minutos foi realizado e no final 1 ciclo de 72º durante 10 min.

Os ciclos foram realizados automaticamente em equipamento apropriado (DNA Thermal Cycler, MJ, EUA). Foram utilizados dois iniciadores (primers) que flanqueiam uma região constante do gene da β 2 - Microglobulina (Tabela 2).

Tabela 2- Iniciadores (primers) que flanqueiam uma região conservada do gene da β 2 – Microglobulina

PRIMERS SEQUÊNCIA (5’ 3’)

β 2 – Microglobulina 1 TCCCCCAAATTCTAAGCAGA β 2 – Microglobulina 2 TCCAACATCAACATCTTGGT

4.7.2 REAÇÃO DE NESTED-PCR PARA HCMV

A reação em cadeia polimerase tipo nested-PCR seguiu o método descrito por Ehrnst et al, 1995 para HCMV, com algumas modificações. Cada reação de amplificação continha 0,5 a 1mg do DNA estudado em volume total de 15μL. Foi utilizado o GoTaq Green Master Mix, 2X, anteriormente descrito.

Na primeira reação de PCR, foram complementados 30 ciclos de amplificação para cada amostra e cada um deles compreendeu: separação de hélices de DNA (aquecimento a 95º durante 1 min); ligação complementar entre os primers e o DNA (temperatura de 55ºC por 1 min); extensão dos primers por ação da Taq DNA polimerase (72º durante 1 min). Um ciclo inicial de 95ºC por 3 minutos foi realizado e no final 1 ciclo de 72º durante 10 min. Na segunda reação de amplificação (nested-PCR) foram complementados 30 ciclos de amplificação para cada amostra e cada um deles compreendeu: separação de hélices de DNA (aquecimento a 95º durante 30 seg); ligação complementar entre os primers e o DNA (temperatura de 57ºC por 45 seg); extensão dos primers por ação da Taq DNA polimerase (72º durante 1 min). Um ciclo inicial de 95ºC por 2 minutos foi realizado e no final 1 ciclo de 72º durante 10 min. Os ciclos foram realizados automaticamente em equipamento apropriado (DNA Biocycler, MJ, EUA).

Foram utilizados dois pares de primers ou iniciadores que delimitam uma região constante do genoma do HCMV. Após as duas reações de amplificação e reamplificação, 5μL do produto da nested-PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2% contendo como corante brometo de etídio para visualização das bandas através de luz ultravioleta. O fragmento obtido do HCMV foi de 167 pares de

bases para as amostras positivas. Nenhum fragmento foi detectado nas amostras negativas.

Os primers utilizados na reação de HCMV estão descritos na Tabela 3.

Tabela 3 - Iniciadores (primers) para HCMV.

Primers externos (5’ 3’) HCMV 1+ HCMV 1- ATGGAGTCCTCTGCCAAGAG CAATACACTTCATCTCCTCG Primers Internos (5’ 3’) HCMV 2+ HCMV 2- GTGACCAAGGCCACGACGTT TCTGCCAGCACATCTTTCTC

4.7.3 REAÇÃO DE NESTED- PCR PARA HHV-6

A reação de nested-PCR para HHV-6 seguiu o método descrito por Wang e colaboradores, com algumas modificações. Na primeira reação (PCR), foram complementados 30 ciclos de amplificação para cada amostra e cada um deles compreendeu: separação de hélices de DNA (aquecimento a 95ºC durante 1 min); ligação complementar entre os primers e o DNA (temperatura de 56ºC por 1 min); extensão dos primers por ação da Taq DNA polimerase (72ºC durante 1 min). Um ciclo inicial de 95ºC por 3 minutos foi realizado e no final 1 ciclo de 72ºC durante 10 min. Na segunda reação de amplificação (nested-PCR) foram complementados 30 ciclos de amplificação para cada amostra e cada um deles compreendeu: separação de hélices de DNA (aquecimento a 95ºC durante 1 min); ligação complementar entre os primers e o DNA (temperatura de 62ºC por 1 min); extensão dos primers por ação da Taq DNA polimerase (72ºC durante 1 min). Um ciclo inicial de 95ºC por 3 minutos foi realizado e no final 1 ciclo de 72ºC durante 10 min. Foi utilizado 5 μL do produto da nested-PCR em gel de agarose a 2% em tampão TEB (TRIS-EDTA-BORATO) 0,1x contendo 0.5 μg/mL de Brometo de Etídio e submetida a eletroforese em imersão e posterior visualização em lâmpada ultravioleta para a comprovação de

bandas de DNA específicas do vírus estudado, usando DNA Ladder Gibco BRL (Life Technologies Corporation, Carlsbad CA, EUA) como padrão de peso molecular de 100 pares de bases (77). Os primers estão descritos na Tabela 4.

Os iniciadores (primers) utilizados para a nested-PCR do HHV-6 (A/B), resultaram em tamanhos de fragmentos diferentes para cada tipo (HHV-6A=195 pb) e (HHV-6B=423 pb) e estão descritos na (Tabela 4).

Tabela 4- Iniciadores (primers) do HHV-6.

4.7.4 REAÇÃO DE NESTED- PCR PARA HHV-7

A PCR e nested-PCR seguiram os métodos descritos por Yalcin e colaboradores com algumas modificações. O DNA extraído do plasma foi processado e as condições da reação seguiram as mesmas da PCR e nested-PCR para HCMV e HHV-6. Na primeira reação (PCR), foram complementados 30 ciclos de amplificação para cada amostra e cada um deles compreendeu: separação de hélices de DNA (aquecimento a 95ºC durante 45 seg); ligação complementar entre os primers e o DNA (temperatura de 57ºC por 45 seg); extensão dos primers por ação da Taq DNA polimerase (72ºC durante 1 min). Um ciclo inicial de 95ºC por 3 minutos foi realizado e no final 1 ciclo de 72º durante 10 min (115).

Na segunda reação de amplificação (Nested-PCR) foram complementados 30 ciclos de amplificação para cada amostra e cada um deles compreendeu: separação de hélices de DNA (aquecimento a 95ºC durante 45 seg); ligação complementar entre os primers e o DNA (temperatura de 57ºC por 45 seg); extensão dos primers por ação da Taq DNA polimerase (72ºC durante 1 min). Um ciclo inicial de 95ºC por 3 minutos foi realizado e no final 1 ciclo de 72º durante 1 min. Foi utilizado 5μL do produto da nested-PCR em gel de Agarose a 2% em

Primers externos (5’ 3’) HHV6 (A/B) 1+ HHV6 (A/B) 1- CAAGCCCTAACTGTGTATGT TCTGCAATGTAATCAGTTTC Primers Internos (5’ 3’) HHV6(A/B) 2+ HHV6(A/B) 2- CTGGGCGGCCCTAATAACTT ATCGCTTTCACTCTCATAAG

tampão TEB (TRIS-EDTA-BORATO) 0,1x contendo 0,5 μg/mL de Brometo de Etídio e submetida a eletroforese em imersão para posterior visualização de bandas de DNA específicas em lâmpada ultravioleta para a comprovação do vírus estudado. Foi utilizado DNA Ladder Gibco BRL como padrão de peso molecular. Os primers de HHV-7 (264 pb) estão descritos na (Tabela 5).

Tabela 5 - Iniciadores (primers) do HHV-7.

Primers externos (5’ 3’) HHV-7 (1+) HHV-7 (1-) AGTTCCAGCACTGCAATCG CACAAAGCGTCGCTATCAA Primers Internos (5’ 3’) HHV-7(2+) HHV-7(2-) CGCATACACCAACCCTACT GACTCATTATGGGGATCGAC

Foram utilizadas amostras de DNA extraído de cultura viral ou plasmídeo com confirmação do gene através de sequenciamento como controles positivos. Em todos os experimentos realizados, foram utilizados dois controles positivos e dois controles negativos, utilizando água destilada estéril.