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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.2 REAÇÃO DE BIORREDUÇÃO:

Para a reação de biorredução foram utilizados três tipos de substrato: a

p-nitroacetofenona, acetofenona e ácido 3-hidroxi-2-metileno-3-(4'-nitrofenil)

propanoato de metila. Os gêneros utilizados como biocatalisadores foram:

Bacillus cereus, Bacillus sp. e Lysinibacillus sphaericus que foram isolados de esponjas de água doce da Amazônia. Em estudo realizado por Andrade et

al.,(2005), cepas do gênero Bacillus biorreduziram derivados de acetofenonas

após 72h de reação. Essa característica foi importante para a seleção das três bactérias isoladas das esponjas.

Na reação de redução com a p-nitroacetofenona as três cepas de bactérias foram anteriormente crescidas durante 48h em meio NA. Após 24h adicionou-se o substrato (p-nitroacetofenona) e foi retirada uma alíquota para analisada no CG.

Após 24h, as três cepas bacterianas apresentaram um sinal com tempo de retenção em 13 minutos (Figura 8, 9 e 10) diferentemente do tempo de retenção do padrão racêmico que foi entre 6,5 e 7,0 minutos (Figura 7), não ocorrendo

37,9% 10,3% 20,7% 3,4% 13,8% 3,4% 10,3% 3,4% Bacillus sp. Delftia sp. Enterobacter sp. Lactococcus sp. Lysinibacillus sp. Paenibacillus sp. Pseudomonas sp. Chromobacterium violaceum

assim a formação esperada de alcoóis racêmicos pela redução da carbonila presente no substrato, contudo houve a formação de um novo produto.

Figura 7: Cromatograma em CG-quiral dos padrões Acetofenona e Álcool racêmico

Figura 8: Cromatograma em CG-quiral da redução da p-nitroacetofenona utilizando a cepa de bactéria UEA 20330 (Bacillus), isolada de esponjas de água doce no Municipio de Parintins/AM

Figura 9: Cromatograma em CG-quiral da redução da p-nitroacetofenona utilizando a cepa de bactéria UEA 20332. (Bacillus), isolada de esponjas de água doce no Municipio de Parintins/AM

Figura 10: Cromatograma em CG-quiral da redução da p-nitroacetofenona utilizando a cepa de bactéria UEA 20334 (Lysinibacillus), isolada de esponjas de água doce no Municipio de Parintins/AM

Assim, a fim de identificar preliminarmente o novo produto foram realizadas análises em CG/EM. Segundo os cromatogramas das análises (Figura 11 A e B) o composto produto obtido apresentou o tempo de retenção em 20 minutos. A comparação do perfil das fragmentações de massa do produto com os dados da biblioteca do equipamento (Wiley 229. LIB), sugeriu que o composto

formado foi a 4-aminoacetofenona com 95 % de similaridade (Figura 11 C), então,

pode-se observar que houve a redução do grupo nitro (NO2) para o grupo amina

(Figura 12). Provavelmente, a bactéria produziu enzimas ativas, do tipo nitroreductas, que teve preferência em reduzir o grupo nitro e não a carbonila, sugere-se que esta reação de biorredução foi quimiosseletiva (FABER, 2004; ROCHA, 2008).

Figura 11: Representação do Cromatograma do CG-Massa. (A) pico majoritário referente a substancia obtida reação de biocatálise; (B) ampliação do pico majoritário presente no cromatograma; (C) estrutura sugerida pelo programa (nome do programa e biblioteca) do produto formado a partir da redução da p-nitroacetofenona obtida com a utilização de cepas de Bacillus, Bacillus e Lysinibacillus.

Figura 12: Esquema de reação para a biorredução da p-nitroacetofenona utilizando bactérias

Na figura 13 pode-se observar que a reação com o substrato acetofenona após sete dias não houve formação de produtos. Sugerindo a ausência de desidrogenase ativa para esse substrato.

Na reação de redução do substrato ácido

3-hidroxi-2-metileno-3-(4'-nitrofenil) propanoato de metila, constatou-se que após sete dias de reação não houve biotransformação de seus grupos funcionais. Este fato, pode ser explicado pelo maior volume do grupo substituinte na posição 1 do composto B na figura 14, impedindo assim a interação necessária entre o substrato e a enzima nitroreductase, resultado contrário ao obtido utilizando o substrato A que apresenta grupo substituinte na posição 1, porém de menor volume conforme a figura 14.

Figura 13: Representação do Cromatograma do CG-Massa do sinal da Acetofenona

CONCLUSÕES

Os métodos empregados permitiram isolar e purificar 217 isolados bacterianos associados às esponjas de água doce de rios da amazonia;

Através da extração de DNA dos isolados bacterianos foi possivel o sequenciamento das amotras pelo gene 16 rDNA.

Análises das sequências de nucleotídeos do gene 16S rDNA possibilitaram a identificação de oito gêneros isolados. São eles: Bacillus sp., Pseudomonas sp., Enterobacter sp. , Paenibacillus sp., Delftia sp., Lysinibacillus sp., Lactococcus sp. e Chromobacterium violaceum.

Das 30 estirpes isoladas, 11 são do gênero Bacillus sp., sendo que não houve diferença entre os isolados com assepsia e sem assepsia.

Com a caracterização das bactérias associada às esponjas criou-se uma coleção inicial.

As cepas UEA 20330 (Bacillus cereus), UEA 20332 (Bacillus sp.) e UEA 20334 (Lysinibacillus sphaericus) apresentaram potencial para biorredução de cetonas.

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