4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.2 REAÇÃO DE BIORREDUÇÃO:
Para a reação de biorredução foram utilizados três tipos de substrato: a
p-nitroacetofenona, acetofenona e ácido 3-hidroxi-2-metileno-3-(4'-nitrofenil)
propanoato de metila. Os gêneros utilizados como biocatalisadores foram:
Bacillus cereus, Bacillus sp. e Lysinibacillus sphaericus que foram isolados de esponjas de água doce da Amazônia. Em estudo realizado por Andrade et
al.,(2005), cepas do gênero Bacillus biorreduziram derivados de acetofenonas
após 72h de reação. Essa característica foi importante para a seleção das três bactérias isoladas das esponjas.
Na reação de redução com a p-nitroacetofenona as três cepas de bactérias foram anteriormente crescidas durante 48h em meio NA. Após 24h adicionou-se o substrato (p-nitroacetofenona) e foi retirada uma alíquota para analisada no CG.
Após 24h, as três cepas bacterianas apresentaram um sinal com tempo de retenção em 13 minutos (Figura 8, 9 e 10) diferentemente do tempo de retenção do padrão racêmico que foi entre 6,5 e 7,0 minutos (Figura 7), não ocorrendo
37,9% 10,3% 20,7% 3,4% 13,8% 3,4% 10,3% 3,4% Bacillus sp. Delftia sp. Enterobacter sp. Lactococcus sp. Lysinibacillus sp. Paenibacillus sp. Pseudomonas sp. Chromobacterium violaceum
assim a formação esperada de alcoóis racêmicos pela redução da carbonila presente no substrato, contudo houve a formação de um novo produto.
Figura 7: Cromatograma em CG-quiral dos padrões Acetofenona e Álcool racêmico
Figura 8: Cromatograma em CG-quiral da redução da p-nitroacetofenona utilizando a cepa de bactéria UEA 20330 (Bacillus), isolada de esponjas de água doce no Municipio de Parintins/AM
Figura 9: Cromatograma em CG-quiral da redução da p-nitroacetofenona utilizando a cepa de bactéria UEA 20332. (Bacillus), isolada de esponjas de água doce no Municipio de Parintins/AM
Figura 10: Cromatograma em CG-quiral da redução da p-nitroacetofenona utilizando a cepa de bactéria UEA 20334 (Lysinibacillus), isolada de esponjas de água doce no Municipio de Parintins/AM
Assim, a fim de identificar preliminarmente o novo produto foram realizadas análises em CG/EM. Segundo os cromatogramas das análises (Figura 11 A e B) o composto produto obtido apresentou o tempo de retenção em 20 minutos. A comparação do perfil das fragmentações de massa do produto com os dados da biblioteca do equipamento (Wiley 229. LIB), sugeriu que o composto
formado foi a 4-aminoacetofenona com 95 % de similaridade (Figura 11 C), então,
pode-se observar que houve a redução do grupo nitro (NO2) para o grupo amina
(Figura 12). Provavelmente, a bactéria produziu enzimas ativas, do tipo nitroreductas, que teve preferência em reduzir o grupo nitro e não a carbonila, sugere-se que esta reação de biorredução foi quimiosseletiva (FABER, 2004; ROCHA, 2008).
Figura 11: Representação do Cromatograma do CG-Massa. (A) pico majoritário referente a substancia obtida reação de biocatálise; (B) ampliação do pico majoritário presente no cromatograma; (C) estrutura sugerida pelo programa (nome do programa e biblioteca) do produto formado a partir da redução da p-nitroacetofenona obtida com a utilização de cepas de Bacillus, Bacillus e Lysinibacillus.
Figura 12: Esquema de reação para a biorredução da p-nitroacetofenona utilizando bactérias
Na figura 13 pode-se observar que a reação com o substrato acetofenona após sete dias não houve formação de produtos. Sugerindo a ausência de desidrogenase ativa para esse substrato.
Na reação de redução do substrato ácido
3-hidroxi-2-metileno-3-(4'-nitrofenil) propanoato de metila, constatou-se que após sete dias de reação não houve biotransformação de seus grupos funcionais. Este fato, pode ser explicado pelo maior volume do grupo substituinte na posição 1 do composto B na figura 14, impedindo assim a interação necessária entre o substrato e a enzima nitroreductase, resultado contrário ao obtido utilizando o substrato A que apresenta grupo substituinte na posição 1, porém de menor volume conforme a figura 14.
Figura 13: Representação do Cromatograma do CG-Massa do sinal da Acetofenona
CONCLUSÕES
Os métodos empregados permitiram isolar e purificar 217 isolados bacterianos associados às esponjas de água doce de rios da amazonia;
Através da extração de DNA dos isolados bacterianos foi possivel o sequenciamento das amotras pelo gene 16 rDNA.
Análises das sequências de nucleotídeos do gene 16S rDNA possibilitaram a identificação de oito gêneros isolados. São eles: Bacillus sp., Pseudomonas sp., Enterobacter sp. , Paenibacillus sp., Delftia sp., Lysinibacillus sp., Lactococcus sp. e Chromobacterium violaceum.
Das 30 estirpes isoladas, 11 são do gênero Bacillus sp., sendo que não houve diferença entre os isolados com assepsia e sem assepsia.
Com a caracterização das bactérias associada às esponjas criou-se uma coleção inicial.
As cepas UEA 20330 (Bacillus cereus), UEA 20332 (Bacillus sp.) e UEA 20334 (Lysinibacillus sphaericus) apresentaram potencial para biorredução de cetonas.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADRIO, J. L.; DEMIAN, A. L. Methods in Biotechnology. Microbial Enzymes and Biotransformations. BARREDO, J. L. (ed.); Humana Press Inc., Totowa, NJ , vol. 17, cap 1, 2005.
AICHER, T. D.; BUSZEK, K. R.; FANG, F. G.; FORSYTH, C. J.; JUNG, S. H.; KISHI, Y.;MATELICH, M. C.; SCOLA, P. M.; SPERO, D. M.; YOON, S. K. Total
synthesis of halichondrin B and norhalichondrin B. J. American Chemical
Society, v. 114, n. 8, p. 3162-3164, 1992.
AMANN, R.I.; LUDWIG, W. & SCHLEIFER, K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.
Microbiological Reviews, v. 59, p. 143-169, 1995.
ANAND, T. P.; BHAT, A. W.; SHOUCHE, Y. S.; ROY, U.; SIDDHARTH , J.; SIDDHARTHA, P. S. Antimicrobial activity of marine bacteria associated with
sponges from the waters of the coast of South East India. Microbiological
Research. v.161, p.252-262, 2006.
ANDRADE, L. H.; COMASSETO, J. V.; RODRIGUES, D. F.; PELLIZARI,
V. H.; PORTO, A. L. M.; Enantioselective reduction of ortho – substituted
acetophenones by bacterial strains isolated from medium enriched with biphenyl or diesel fuel. Journal of Molecular Catalysis B. Enzymatic. v.33, p.73-79, 2005.
ARILLO A.; BAVESTRELLO G.; BURLANDO B.; SARA M. Metabolic integration between symbiotic cyanobacteria and sponges: a possible mechanism.
Marine Biology. v. 117, p. 159–162, 1993.
BATISTA, I. H. Biorremediação de ambientes aquáticos contaminados
por resíduos de petróleo: Um estudo com bactérias isoladas de Eichornia
crassipes na Amazônia. Tese (Doutorado em Biotecnologia). Universidade Federal do Amazonas, 2009.
BEER, S.; ILAN, M. In situ measurements of photosynthetic irradiance responses of two Red Sea sponges growing under dim light conditions. Marine
Biology. v. 131, p.613-617, 1998.
BEWLEY C. A.; HOLLAND, N. D.; FAULKENER, D. J. Two classes of metabolites from Theonella swinhoei are localized in distinct populations of
bacterial symbionts. Cellular and Molecular Life Sciences, v. 52, n. 7, p. 716-22,
1996.
BRUSCA R.C; BRUSCA G. J. Phylum Porifera: the sponges
Invertebrates. Massachusetts: Sinauer, 1990.
CANHOS, V. P; MANFIO, G. P; VAZOLLER, R. F.; PELLIZARE, V. H.
Diversidade no Domínio Bactéria. In: Joly, C. A.; Bicudo, C. E. M. (orgs).
Biodiversidade do Estado de São Paulo, Brasil: síntese do conhecimento ao
final do século XX. São Paulo: FAPESP, 1999.
CARVALHO, M. P.; ABRAHAM, W. R.; MACEDO, A. J. Microrganismos em favor da saúde humana. Revista Liberato, Novo Hamburgo, v. 9, n. 11, p. 77-81, 2008.
CIHANGIR, N., ; SARIKAYA, E. Investigation of lipase production by a
new isolated of Aspergillus sp. World Journal of Microbiology &
Biotechnology, n. 20, p.193–197, 2004.
COHAN, F. M. Bacterial Species and Speciation. Systematic Biology,
vol. 50, n. 4, p. 513-524, 2001.
COWAN, M. M. Plant products as antimicrobial agents. Clinical
microbiology Reviews, v. 2, n. 4, p. 564-82, 1999.
DEMIRJIAN, D. C.; SHAH, P. C.; MORIS-VAS, F.; Biocatalysis- From
discovery To Application . cap. 1, p. 200, 1999,
FABER, K. Biotransformations in Organic Chemistry, 3ª edição, Berlin,
FAULKNER, D.J. Marine natural products. Natural Products Report, n. 17, p. 7-55, 2000.
FAULKNER, D.J. Marine natural products. Natural Products Report, n.
19: 1-48, 2002.
GALM, U.; SHEN, B. Natural Product Drug Discovery: The Times Have
Never Been Better. Chemistry Biology, n. 14, p. 1098-1104, 2007
GELSOMINO, R; Vancanneyt M.; Vandekerckhove, T.M e Swings J.
Development of a 16s rRNA primer for the detection of Brevibacterium spp.
Letters in Applied Microbiology, v. 38, n. 6, p. 532-535, 2004.
GILBERT, J. J.; Allen, H. L.Chlorophyll and primary productivy of some
green freshwater sponges. Internationale Revue der Gesamten Hydrobiologie.
v. 58, p.633–658, 1973.
HAYGOOD, M. G.; SCHMIDT, E.W.; DAVIDSON, S.K.; FAULKNER, D.J. Microbial symbionts of marine invertebrates: opportunities for microbial
biotechnology. Journal Molecular Microbiology Biotechnology. v. 1, p.33–43,
1999.
HAWKER, L. E.; LINTON, A. H.; FOLKES, B. F.; CARLILE, M. J. An
introduction to the biology of micro-organisms. London, 1960.
HENTSCHEL, U.; Usher, K. M.; Taylor, M. W. Marine sponges as
microbial fermenters. FEMS Microbiology Ecology, Wien, v. 55, p. 167–177,
2006.
HENTSCHEL, U.; HOPKE, J.; FRIEDRICH, A. B,; WAGNER, M.; HACKER, J.; MOORE, B. S. Molecular evidence for a uniform microbial
community in sponges from different oceans. Applied Environmental
Microbiology. v.68, p.4431– 4440, 2002.
HOLLER, U.; WRIGHT, A. D.; MATTHEE, G. F.; KOENIG, G. M.; DRAEGER, S.; AUST, H. J, SCHULZ, B. Fungi from marine sponges: diversity, biological activity and secondary metabolites. Mycological Research. v. 104, p.1354–1365, 2000.
HOOPER, J. N. A. & VAN SOEST, R. W. M. Systema Porifera: a guide
to the classification of sponges, v1. New York: Kluwer Academic/Plenum
Publishers, 2002
IMHOFF J.F; STÖHR, R.. Sponge-associated bacteria. In: Müller WEG,
editor. Marine molecular biotechnology, New York: Springer-Verlag, 2003.
KIM, M. K. KIM, H. S.; KIM B. O.; YOO, S. Y.; SEONG, J. H.; KIM, D. K.; LEE, S. E.; CHOE, S. J.;PARK, J. C.; MIN, B. M.; JEONG, M. J.; KIM, D. K.; SHIN, Y. K.; KOOK, J. K. Multiplex PCR using conserved and specific-specific 16S rDNA primers for simultaneous detection of Fusobacterium nucleatum and Actinobacillus actinomycetemcomitans. Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 14, p. 110-115, 2004.
LEE, O. O.; WONG, Y. H.; QIAN, P. Y. Inter – and Intraspecific Variation of Bacterial Communities Associated with Marine Sponges from San Juan Island,
Washington. Applied and Environmental Microbiology. v.75, n.11, p.
3513-3521, 2009.
LEHMKUHL, A. L. Biorredução da 4-Aminoacetofenona Catalisada por
Células de Saccharomyces cerevisiae sp. em sistemas bifásicos. Dissertação
(Mestrado em Química), Universidade Regional de Blumenau, Santa Catarina, 2006.
LEHNINGER, A. L. N, D.L; Princípios da Bioquímica. 5º ed., São Paulo:
Sarvier, 2011.
LI, C.W.; CHEN, J.Y. & HUA, T.E.. Precambrian Sponges with Cellular
Structures. Science, v. 279, p. 879–882.1998.
LI, ZHIYONG. Advances in Marine Microbial Symbionts in the China Sea
and Related Pharmaceutical Metabolites. Marine Drugs. v.7, p.113-129, 2009.
LUDWIG, W.; SCHLEIFER, K. H. Bacterial phylogeny based on 16s and
23s rRNA sequence analysis. FEMS Microbioloy Reviews, v. 15, p. 155-173,
MAGNINO G.; SARA A.; LANCIONI T.; GAINO E. Endobionts of the coral
reef sponge Theonella swinhoei (Porifera, Demospongiae). Invertebrate Biology.
v.118, p.213–220, 1999.
MALAJOVICH, M. A. Biotecnologia: Fundamentos. Edições Biblioteca Max Feffer do Instituto de Tecnologia ORT, Rio de Janeiro, 2009.
MANCONI, R; PRONZATO, R.: Sub-order Spongillina subord. nov.:
Freshwater sponges. In Hooper, J.N.A. & R.W.M. Van Soest, Systema Porifera:
A guide to the Classification of Sponges, New York, Kluwer Academic/Plenum
Publ.p. 921-1019, 2002.
MENEZES, C. B. A,; BANUGLI – SANTOS, R. C. MIQUELETTO, P. B.;
PASSARINI, M. R. Z.; SILVA, C. H. D.; JUSTO, M. R.; LEAL, R. R.; FANATTI –
GARBOGGINI, F.; OLIVEIRA, V. M.; BERLINCK, R. G. S.; SETTE, L. D. Microbial diversity associated with algae, ascidians and sponge from the North coast of São
Paulo state, Brazil. Microbiological Research. v. 165, p.466-482, 2010.
MÜLLER, C. B.; KRAUSS, J. Symbiosis between grasses and asexual
fungal endophytes. Current Opinion in Plant Biology, n. 8, p. 450–456, 2005.
MUSCHOLL – SILBERHORN, A.; THIEL, A.; IMHOFF, J. F.; Abundance
and Bioactivity of Cultured Sponge – Associated Bacteria from Mediterranean
Sea. Microbial Ecology. v.55, p.94-106, 2008.
NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M.; NADER, K. M. J. Natural Products as Sources of New Drugs over the Period 1981-2002. Journal of Natural Products, v. 66, n. 7, p. 1022-1037, 2003.
PARFENOVA, V. I; TERKINA, I. A.; KOSTORNOVA, T. Y.; NIKULINA, I. G.; CHHERNYKH, V. I.; MAKSIMOVA, E. A. Microbial Community of Freshwater
Sponges in Lake Baikal. Biology Bulletin. v.35, n. 4, p.374-379, 2008.
PENNEY, J. T.; RACEK, A. A. Comprehensive revision of a worldwide
collection of freshwater sponges (Porifera: Spongillidae). Bulletin of the
PETRINI, O.; SIEBER, T. N.; TOTI, L.; VIRET, O. Ecology, metabolite production, and substrate utilization in endophytic fungi. Natural Toxins, v. 1, p. 185-196, 1992.
PIEL, J. Metabolites from symbiotic bacteria. Natural Product Reports, v.
21, p. 519‐538, 2004
PINHEIRO, U. S.. Contribuições à taxonomia e biogeografia das
esponjas de águas continentais brasileiras. Tese (Doutorado em Ciências
Biológicas – Zoologia). Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro. 2007
PROCÓPIO, A. R. L. Diversidade da comunidade bacteriana da
rizosfera de arroz resistente ao propanil e seu potencial biotecnológico.
Tese (Doutorado em Biotecnologia). Universidade de São Paulo, 2007
PROCÓPIO, R. E. L. Diversidade bacteriana endofítica de Eucalyptus
spp. e avaliação do seu potencial biotecnológico. Tese de Doutorado em
Biotecnologia. Universidade de São Paulo, São Paulo,2004.
PROKSCH, P.; EDRADA, R.A.; EBEL, R.. Drugs from the sea current
status and microbiological implications. Applied Microbiology and
Biotechnology, v. 59 p. 125-134, 2002.
RADJASA, O. K. Antibacterial activity of sponge associated – bacteria isolated from North Java Sea. Journal of Coastal Development. v.10, n.3, p.143-150, 2007.
RÜTZLER K. Associations between Caribbean sponges and
photosynthetic organisms. In: Rützler K. New perspectives in sponge biology. Smithsonian Institution Press, Washington, DC, pp 455–466, 1990.
RÜTZLER, K. Associations between Caribbean sponges and
photosynthetic organisms. In: K. Rützler (ed.), New perspectives in sponge
SABU, A.; Nampoothiri, k. M.; Pandey, A. In: Methods in Biotechology, Vol. 17: Microbial Enzymes and Biotransformations; Barredo, J. L. (ed.) Humana Press Inc.; Totowa, NJ, cap.4, 2005.
SANTAVY D. L.; WILLENZ P.; COLWELL R. R. Phenotypic study of bacteria associated with the Caribbean sclerosponge, Ceratoporella nicholsoni.
Applied and Environmental Microbiology. v. 56,p. 1750–1762, 1990.
SARA M.; Liaci L. Symbiotic associations between zooxanthellae and two
marine sponges of the genus Cliona. Nature. v. 203, p.321–323, 1964.
SCHMIDT, E. W.; OBRAZTOVA, A. Y.; DAVIDSON, S. K.; FAULKNER, D. J.; HAYGOOD, M. G. Identification of the antifungal peptide-containing symbiont of
the marine sponge Theonella swinhoei as a novel Delta-Proteobacterium
Candidatus Entotheonella palauensis. Marine Biology. v. 136, p.969–977, 2000.
SEXTON A. C, MINIC Z, COZIJNSEN A. J, PEDRAS M. S. C, HOWLETT B. J A glucosyltransferase of the plant pathogen Sclerotinia sclerotiorum detoxifies
a phytoalexin, brassinin, from Brassica species. Fungal Genetics and Biology, n.
46, p. 201-209, 2009.
SIMPSON, T.L. The cell biology of sponges. Springer-verlag: New York,
1984.
SIPKEMA, D.; OSINGA, R.; SCHATTON, W.; MENDOLA, D.; TRAMPER, J.; WIJFFELS, R.H. Large-scale production of pharmaceuticals by marine sponges: sea, cell, or synthesis? Biotechnology and Bioengeering, v. 90, n. 2, p. 201-22, 2005.
STACKEBRANDT, E.; GOODFELLOW, M. Nucleic acid techniques in
bacteria systematics. New York: John Wiley & Sons, 1991.
STEELE, D. B.; STOWERS, M. D. Techniques for selection of industrially
important microorganisms. Annual Review of Microbiology, v. 45, p. 89-106,
STEVENSON, G. B. et al. Biologia dos fungos, bactérias e vírus. São Paulo: Universidade de São Paulo, 1974.
STINSON, S.C. Chiral Drugs. Chemical & Engineering News, n. 72 p. 38-72, 1994.
STROBEL, G.; DAISY, B. Bioprospecting for Microbial Endophytes and
Their Natural Products. Microbiology Molecular Biology Reviews, v. 67, n.4, p.
491-502, 2003.
TAYLOR, M.W.; RADAX R.; STEGER D.; WAGNER, M..Sponge-Associated Microorganisms: Evolution, Ecology,and Biotechnological Potential.
Microbiology and Molecular Biology Reviews. v.71, n.2, p. 295–347. 2007.
THIEL, V.; IMHOFF, J. F. Phylogenetic identification of bacteria with
antimicrobial activities isolated from Mediterranean sponges. Biomolecular
Engineering, v. 20, p. 421-423, 2003.
TURQUE, A.S, et. al. Microrganismos Associados a Poríferos: Potencial
Biotecnológico da Microbiota Associada às Esponjas Marinhas. Biotecnologia
Ciência & Desenvolvimento, n. 37, p. 64-69, 2007
UNSON, M. D.; HOLLAND, N. D.; FAULKNER, D. J. A brominated secondary metabolite synthesized by the cyanobacterial symbiont of a marine sponge and accumulation of the crystalline metabolite in the sponge tissue. Marie Biology. v.119, p.1–11, 1994.
VAN DE PEER, Y.; CHAPELLE, S.; DE WACHTER, R. A quantitative map of nucleotides substitution rayes in bacterial rRNA. Nucleic Acids Research. v. 24, p. 3381-3391, 1996.
VINCENTE, V. P. Response of sponges with autotrophic endosymbionts
during the coral-bleaching episode in Puerto Rico. Coral Reefs. v.8, p.199–202,
1990.
VIEIRA, M. R. Estudo da Biorredução de Compostos Carbonílicos por
Linhagens de Saccharomyces cerevisiae sp. Dissertação (Mestrado em
VOLKMER-RIBEIRO, C. Esponjas. In: JOLY, C. A.; BICUDO, C. E. M. (orgs). Biodiversidade do Estado de São Paulo, Brasil: síntese do conhecimento ao final do século XX. São Paulo: FAPESP, 1999.
VOLKMER-RIBEIRO, C.; TAVARES, M. C. M. Comunidades de esponjas do bentos rochoso, dos lagos de várzea e dos lagos de hidrelétricas da bacia
Amazônica. In: VI Congresso Brasileiro de Limnologia, 1997, São Carlos. Anais.
São Carlos: UFSCAR, 1997.
VOLKMER-RIBEIRO, C. Porifera. In: Hurlbert, S.H. et al. (ed.) Aquatic biota of tropical South America. San Diego, CA: San Diego State University, 1981.
WILKINSON, C. R., GARRONE, G., e VACELET J. Marine sponges discriminate between food bacteria and bacterial symbionts: electron microscope radioautography and in situ evidence. Proceedings of the Royal Society of London
Series B, Biological Sciences, v. 220, n. 1221, p. 519-528, 1984.
WILKINSON, C. R. Microbial associations in sponges. 1. Ecology, physiology and microbial populations of coral reef sponges. Marine Biology. v. 49, p.161–167, 1978.
WILKINSON C. R. Symbiotic interactions between marine sponges and
algae. In: Reisser W. Algae and symbioses. Biopress, Bristol, UK, pp 112–151,
1992.
WILKINSON, C.R. Significance of microbial symbionts in sponge evolution
and ecology. Symbiosis. v.4, p.135-146, 1987.
WEBB V. L,; MAAS E. W. Sequence analysis of 16S rRNA gene of
cyanobacteria associated with the marine sponge Mycale (Carmia) hentscheli.
FEMS Microbiology Letters. v. 207, p.43–47, 2002.
WEBSTER, N. S.; WILSON, K. J.; BLACKALL, L. L.; HILL, R.T. Phylogenetic Diversity of Bacteria Associated with the Marine Sponge Rhopaloeides odorabile, Applied Environmental. Microbiology, v. 67, p. 434– 444, 2001.
WEISZ, J. B.; HENTSCHEL, U.; LINDQUIST, N.; MARTENS, C. S. Linking abundance and diversity of sponge-associated microbial communities to metabolic differences in host sponges. Marine Biology. v. 152, p.475-483, 2007.
WERKMAN, C. H.; WILSON, P.W. et al,. Bacterial physiology. New York: Academic Press, 1951.