Reação em cadeia da Polimerase (PCR)

Tendo em vista que durante todo o trabalho o fungo A. alternata foi inoculado e re-isolado várias vezes do citros suscetível Tangor ‘Murcott’, foi necessário em alguns momentos fazer a reação da cadeia da polimerase (PCR) a fim de garantir o gênero e a espécie.

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica de biologia molecular que permite replicação in vitro do DNA de forma extremamente rápida. Com a PCR, quantidades mínimas de material genético podem ser

amplificadas milhões de vezes em poucas horas. O método PCR é usado habitualmente nos laboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade de tarefas, como a detecção de doenças hereditárias, que é a identificação de "impressões digitais" genéticas, a construção de árvores filogenéticas (árvores de relação entre espécies), a clonagem de genes, testes de paternidade, exames para detecção de agentes patogênicos e etc.

A PCR está desenhada de acordo com o princípio natural de replicação de DNA. Este processo decorre em três passos, que em conjunto se designam como um ciclo e que se repete em um número específico de vezes:

a- Ciclo I: Desnaturação

b- Ciclo II: Hibridização ou Anelamento c- Ciclo III: Extensão

Para ocorrer à reação é preciso usar um termociclador, um aparelho que controla e alterna as temperaturas durante os períodos programados de tempo para o número apropriado de ciclos, que geralmente vão de 30 a 40 ciclos.

a- Ciclo I: Desnaturação: A temperatura elevada (geralmente >90ºC) separa a dupla fita de DNA em dois filamentos, sendo este processo conhecido como “desnaturação”. Os dois filamentos ou cadeias de DNA são mantidos juntos por ligações de hidrogênio que, por serem relativamente fracas, quebram- se a altas temperaturas, ao passo que as ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligações covalentes mais fortes, permanecem intactas.

b- Ciclo II: Hibridização ou Anelamento: O objetivo da PCR não é replicar a cadeia inteira de DNA, mas apenas replicar a seqüência de interesse que é única no organismo. Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da seqüência alvo: estes iniciadores são curtas seqüências sintéticas de nucleotídeos, entre 20 e 30 bases. Numa PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de

desnaturação. O início da seqüência de DNA alvo é marcada pelos primers que se ligam (hibridizam) com a seqüência complementar. Temperatura de anelamento ou hibridização: normalmente encontra-se entre 40 ºC e 65 ºC, dependendo do comprimento dos primers e da sua seqüência. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas seqüências iniciadoras se liguem a seqüência alvo com elevada especificidade.

c- Ciclo III: Extensão: Após a ligação dos primers ou iniciadores às seqüências complementares de DNA, eleva-se a temperatura a aproximadamente 72 ºC e a enzima Taq polimerase faz a replicação da cadeia de DNA. A Taq polimerase é uma polimerase de DNA termo-estável recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao contrário de outras polimerases, se mantém ativa a temperaturas elevadas. O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde estão ligados os primers), incorporando os nucleotídeos complementares à seqüência alvo e utilizando os dNTPs livres em solução. A extensão inicia-se sempre no extremo 3’ do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples.

No final do primeiro ciclo da PCR, encontramos duas novas cadeias de DNA idênticas a original. A DNA polimerase não reconhece o final da seqüência, assim, as novas cadeias sintetizadas têm o seu inicio definido pelo primer, mas a sua extremidade 3’ não está definida, podendo haver fragmentos de diferentes tamanhos. No entanto, no ciclo seguinte, esta cadeia vai servir de molde à síntese de uma nova cadeia, limitando o primer a outra extremidade da cadeia. A cadeia de DNA sintetizada a partir desse molde terá o compromisso definido, com os limites definidos pelos primers. Após alguns ciclos as cadeias de DNA que correspondem ao tamanho exato da seqüência alvo estão presentes em um número muito maior do que as seqüências de comprimento variável. A seqüência flanqueada pelos primers é a parte do DNA que se amplifica. Após o

término da reação é feita uma eletroforese em gel de agarose 1-3% corado com brometo de etídeo para a visualização do produto amplificado.

Para isso ocorrer é necessário utilizar marcadores moleculares,os quais podem ser definidos como todo e qualquer fenótipo molecular oriundo de um gene expresso ou de um segmento de DNA (Ferreira & Grattapaglia, 1996).

Na identificação de gênero e espécie do fungo A. alternata foram utilizados primers sendo que as seqüências estão descrita nas TABELAS 3.2 e 3.3.

TABELA 3.2- Primes utilizados na PCR para a identificação do gênero Forward

Primer AaltrF1 5'-GGCGGGCTGGAACCTC-3'

Reverse Primer

AltrR1-1 5' GCAATTACAAAAGGTTTATGTTTGTCGTA-3'

TABELA 3.3- Primes utilizados na PCR para a identificação da espécie Forward Primer

LinF  5'-TATCGCCTGGCCACCTACGC-3' 

Reverse Primer

LinR  5'-TGGCCACGACAACCCACATA-3' 

A amplificação do DNA por PCR para a confirmação da identidade do isolado de A. alternata foi realizada em reações de 25µL contendo Taq Buffer [tampão de amplificação (1X)], 200µM de dNTP MIX (misturas de

nucleotídeos), 0,02mM de MgCl2, 50µM dos iniciadores citados nas TABELAS

3.2 e 3.3, 1,25u Taq DNA polimerase (enzima) e 2µL de DNA (aproximadamente 200-250 ng). A amplificação por PCR foi realizada em termociclador inicializada com desnaturação a 95°C por cinco minutos seguidos

de 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 65 °C por 45 segundos e extensão a 72 °C por 45 segundos. A extensão final foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Os produtos amplificados foram resolvidos por

eletroforese em gel de agarose (1%) contendo brometo de etídio (0,5 μg/mL de

gel) à 80V/cm. O peso molecular foi comparado ao padrão 1 Kb, e o gel foi fotografado após a corrida com foto-documentador.

A identificação do micro-organimo foi realizada com o auxílio do mestrando do laboratório do Departamento de Química da UFSCar Evandro Luis Prieto, no Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Profa. Dra. Dulce Helena Ferreira de Souza.