Reações adversas de rouquidão, disfagia e odinofagia e a expressão da proteína

A Tabela 9 mostra a correlação do percentual de expressão da proteína p53 nas células não irradiadas (controle) com os graus de reações adversas apresentadas por cada um dos pacientes.

NA- reação não apresentada; + leve; ++ moderada e +++ severa

Para os níveis de rouquidão, o coeficiente de correlação de Spearman (-0,7107) indica uma forte correlação negativa com a expressão basal de proteína p53, sendo esta correlação significativa estatisticamente ao nível de 5% (p = 0,0212). Este dado indica que quanto maior o nível de expressão basal individual da proteína p53, menos severa será a reação adversa de rouquidão.

Para as reações adversas de disfagia e odinofagia o coeficiente de Spearman foi de -0,7135, o que confirma forte correlação negativa entre a expressão da p53 e a intensidade destas reações. Esta correlação foi estatisticamente significante ao nível de 5% (p = 0,0232). A correlação apresentada indica que quanto maior os níveis de expressão basal da p53, monos severas serão as reações de disfagia e odinofagia.

Numa segunda análise podemos separar 2 grupos distintos: o primeiro apresentou baixa expressão da proteína (em branco) enquanto que no segundo

Pacientes Expressão da proteína p53 (%)

Controle (Não irradiado) Rouquidão Disfagia / Odinofagia

A 0 ++ ++ B 0.03 ++ ++ C 3.04 + + D 4.2 ++ ++ E 4.4 ++ ++ F 7.13 + + G 8.04 + + H 11.02 + NA I 12.28 + + J 15.02 + + Reações adversas Tabela 9 - Expressão basal individual da proteína p53 e correlação com os graus de

observou-se alta expressão da proteína p53 (em cinza). O primeiro grupo apresentou reações adversas mais severas quando comparados ao segundo grupo.

O fato do tecido sadio apresentar maior expressão basal da proteína p53, parece servir como um “alerta” inicial, que faz com que o tecido biológico responda de forma mais eficaz quando agredido pelas radiações ionizantes. É como se o organismo já tivesse preparado para uma resposta imediata ao sofrer estresse, diferente dos que expressam pouca p53 basal, que teria que aumentar os níveis destas para responder ao mesmo dano.

A resposta celular ao dano radioinduzido depende da quantidade de p53 ativada e do tempo de duração na sua ativação, isto é, quanto mais forte e mais longa for a ativação da p53, maiores a chance de respostas mais efetivas, como o encaminhamento da célula para apoptose (GUDKOV; KOMAROVA, 2003). Os resultados do presente trabalho mostram que indivíduos que possuem, portanto, uma alta expressão basal da proteína p53, portanto, mais tempo de contato com a p53 ativada, teria mais eficiência no processo de encaminhamento da célula danificada ao reparo celular ou à apoptose ao ser exposta à agressão por radiações ionizantes.

Em estudos realizados em células do timo, foi possível observar que as células que não expressavam p53 morreram de outra forma que não apoptose, já as células que expressavam p53 na sua forma ativa eram eliminadas por apoptose após serem irradiadas (GUDKOV; KOMAROVA, 2003).

Diversos estudos têm observado que o acúmulo da proteína p53 leva à parada do ciclo celular que pode facilitar o reparo do DNA e/ou levar à apoptose radioinduzida (FEI; EL-DEIRY, 2003). Os pacientes que tiveram menor expressão da proteína p53, provavelmente tiveram também menor morte celular induzida por apoptose e possível aumento de morte celular por outras vias, como a necrose, fato que gerou fibrose do tecido sadio e posterior aumento no grau da reação adversa de rouquidão destes pacientes. Desta forma, é provável que pacientes que já possuem baixa expressão basal

da proteína p53 quando submetidos à exposição às RIs podem ter a morte via apoptose diminuída, e consequente aumento da morte por outras vias, como a necrose, e consequente aumento de inflamação tecidual.

A disfagia e odinofagia, bem como a rouquidão são resultados da formação de edema. O edema é um dos efeitos da radioterapia, e ocorre devido ao crescimento da permeabilidade vascular causada pelo bloqueio dos vasos sanguíneos e linfáticos e por mediadores inflamatórios liberados por células que sofreram danos após irradiação e não foram encaminhadas para a apoptose (ICHIMURA et al., 1997). A inflamação é a resposta primária de danos do tecido biológico e se caracteriza pela liberação de vários mediadores que regula a permeabilidade vascular (MANIKANTAN et al., 2009). O processo inflamatório também induz fibrose tecidual, o que leva, por exemplo, a um aumento da rouquidão (WANG et al., 1998; BARCELLOS-HOFF et al., 2005).

Considerando estes dados da literatura, pacientes que apresentaram uma baixa expressão basal da proteína p53 apresentaram um alto grau de inflamação tecidual e consequente aumento nos graus de rouquidão, disfagia e odinofagia, provavelmente tiveram um retardamento do processo de checagem do ciclo celular. Com isso as células danificadas pela radiação não puderam ser reparadas ou encaminhadas para a apoptose em 72 horas (tempo de cultivo celular utilizado na pesquisa), ou seja, como as células ainda estavam no processo de checagem e/ou sofrendo processo de morte por outras vias, houve um aumento da inflamação e consequente aumento das reações adversas apresentadas por estes pacientes.

Por outro lado, pacientes que apresentaram alto nível de expressão basal da proteína p53, o que provavelmente levou ao aumento de reparação do dano celular e grande parte das mortes via apoptose, que possibilita uma recuperação tecidual mais rápida, associada a uma das características da apoptose celular, que é o não aparecimento de inflamação, devido à formação dos chamados corpos apoptóticos e rápida fagocitose destes. A fagocitose dos corpos apoptóticos evita a liberação de restos celulares no tecido biológico, prevenindo assim a produção de citocinas indutoras de

reação inflamatória, diminuindo assim, o grau das reações adversas (SCHLEGEL; WILLIAMSON, 2001; KUROSAKA et al., 2003).

Na Tabela 9 é possível observar ainda, que dentre os pacientes que apresentaram baixo nível de expressão (em branco), o paciente C apresentou rouquidão, disfagia e odinofagia consideradas leves, sendo considerado um ponto fora da curva. Uma das possíveis explicações se deve ao fato de o paciente C ser o único dentre os 10 que não era fumante. De acordo com Hocevar-Boltezar e colaboradores (2009), o tabagismo influencia na qualidade de voz e no nível de rouquidão após o tratamento de radioterapia.

Considerando todas as impressões, o resultado das correlações sugere o uso da avaliação da expressão dos níveis basais da proteína p53 como teste preditivo de eficácia da resposta celular dos tecidos normais contra os danos causados pela radiação. Esta análise parece predizer a radiossensibilidade em pacientes submetidos à radioterapia. É necessário ainda mais estudos, com um número maior de indivíduos, para que se possa avaliar a tendência mostrada no presente trabalho.

A Tabela 10, abaixo, mostra os níveis das reações adversas (rouquidão, disfagia e odinofagia) nos pacientes, de acordo com o percentual de células que expressaram a proteína p53 após irradiação com dose de 2 Gy. Para melhor visualização os dados foram organizados em ordem crescente de expressão da proteína p53.

Para a reação adversa de rouquidão o valor do coeficiente de Spearman foi de - 0,2132, havendo portando, uma correlação fraca e não significativa estatisticamente ao nível de 5%. Para as reações de disfagia e odinofagia o valor do coeficiente de Spearman foi de - 0,2010, sendo também uma correlação fraca e não significativa.

Tabela 10 - Expressão da proteína p53 em linfócitos irradiados com dose de 2 Gy e os níveis de reações adversas dos pacientes após a radioterapia

Pacientes Expressão da proteína p53 (%)

2 Gy Rouquidão Disfagia Odinofagia Pele

G 5.08 + + + +++ A 6 ++ ++ ++ +++ B 6.85 ++ ++ ++ ++ F 8.37 + + + + E 9.63 ++ ++ ++ + H 10.63 + NA NA + C 13.32 + + + + I 22.02 + + + ++ D 23.7 ++ ++ ++ ++ J 24.4 + + + ++ Efeitos colaterais

NA- reação não apresentada; + leve; ++ moderada e +++ severa;

Estes dados corroboram com Ribeiro e colaboradores (2000) que relacionaram a expressão da proteína p53 por imunohistoquímica após irradiação com efeitos clínicos em pacientes com câncer retais submetidos à radioterapia. Estes autores também detectaram nenhuma correlação.

Ponten e colaboradores (2001) avaliaram a expressão da p53 por imunohistoquimica após irradiação de 2 Gy em células da pele, sendo observada uma grande diferença inter-individual na expressão da p53. Os pesquisadores correlacionaram ainda os resultados com as reações da radioterapia ligadas à inflamação, como edema e eritema e foi observado que a expressão desta proteína não reflete a resposta adversa individual. Pontem e colaboradores (2001) ainda afirmam que o mecanismo que regula o crescimento da p53 em resposta ao dano radioinduzido necessita de estudos adicionais para ser melhor elucidado.

Ferreira (2012), num trabalho complementar a este, observou forte correlação entre a sobrevivência celular e as reações adversas dos mesmos pacientes avaliados neste trabalho após tratamento de radioterapia para câncer de laringe em estágios T1 e T2. Os dados obtidos são apresentados na Tabela 11. Observou-se que quanto maior o

índice de sobrevivência celular maiores foram os níveis de reações adversas apresentados pelos pacientes.

Barber e colaboradores (2002) também mostraram uma correlação inversa entre morte celular induzida por radiação e a toxicidade apresentada pelos pacientes após radioterapia, isto é, quanto maior o nível de morte de linfócitos irradiados, menor será o risco de desenvolvimento de reações adversas severas. A variedade da resposta à radioterapia está associada com a condição genética individual do paciente.

Da análise desta Tabela 11, é possível observar que a maioria dos pacientes que apresentaram expressões basais mais baixas par a p53 teve um alto percentual de sobrevivência celular (69,17 ≤ 74,09), após irradiação com dose de 2,5 Gy. Já os pacientes do grupo 2 (primeira coluna em cinza), que apresentaram os níveis expressão basal mais altos, tiveram menores índices de sobrevivência celular após irradiação (30,84 ≤ 60,14).

Foi realizado o teste estatístico de correlação de Pearson onde a sobrevivência foi dividida em 2 grupos distintos: Grupo 1: sobrevivência de 30,84% até 52,5% e

Expressão da proteína p53 (%) Sobrevivência celular % (Ferreira, 2012)

Controle (Não irradiado) 2,5 Gy

0 54.88 0.03 74.09 3.04 69.17 4.2 72.9 4.4 70.28 7.13 54.3 8.04 60.14 11.02 30.84 12.28 56.98 15.02 50

Tabela 11 - Comparação dos níveis basais da p53 com a sobrevivência das células de cada paciente irradiada com a dose de 2,5 Gy de Ferreira (2012)

Grupo 2: sobrevivência de 52,5% até 74,09%. O número 52,5 foi achado através de uma média simples entre o maior e o menor percentual de sobrevivência celular. Como resultado, obteve-se o coeficiente de correlação de Pearson no valor de – 0,76, isto é, apresentou-se uma forte correlação estatisticamente significante entre a expressão da proteína p53 e a sobrevivência celular.

A correlação da expressão basal de p53 dos pacientes com a sobrevivência celular destes mesmos pacientes analisadas por Ferreira (2012) era esperada justamente devido ao importante papel da p53 na apoptose de células que sofreram esse tipo de estresse físico. A proteína p53 por estar envolvida no processo de parada celular, e consequente controle na proliferação, bem como no processo de apoptose (KLUMB et al., 2002) quando está em níveis altos nas células faz com que estas diminuam o grau de proliferação e aumentem os níveis de apoptose, o que explica a correlação deste grupo com as sobrevivências celulares mais baixas.

Todos estes resultados têm dado suporte à teoria de que o estudo das respostas induzidas pela radiação em linfócitos do sangue periférico é um método eficaz para predizer a resposta dos tecidos normais à radiação. Basicamente duas relações têm sido utilizadas para predizer os níveis de reações adversas de tecidos sadios após radioterapia: Altos níveis de danos ao DNA foram associados com altos níveis de reações severas. Em contraste, baixos níveis de morte celular estão associados com alto nível de toxicidade dos tecidos sadios (HENRÍQUEZ-HERNÁNDEZ et al., 2012).

Com isso, o presente trabalho indica que a avaliação da expressão dos níveis basais individuais da proteína p53 por citometria de fluxo pode ser um bom indicador de radiossensibilidade individual para as reações adversas de rouquidão, disfagia e odinofagia em radioterapia de câncer de laringe, embora seja necessário o estudo com maior número de pacientes.

6 CONCLUSÃO

 Há variação interindividual significativa da expressão basal da proteína p53, bem como um aumento significativo e variável da sua expressão após a irradiação das células dos pacientes;

 Não foi possível correlacionar os graus de reações adversas da pele com os níveis de expressão basais e pós-irradiação da p53;

 As reações adversas de rouquidão, disfagia e odinofagia não puderam ser correlacionadas com os níveis de expressão da p53 em linfócitos irradiados com a dose de 2 Gy;

 Houve forte correlação entre os níveis basais individuais de expressão da proteína p53 e as reações adversas de rouquidão, disfagia e odinofagia, onde quanto maior a expressão basal da p53, menor é o grau de severidade das reações adversas;

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