Reconfirmação da inserção do transposon no mutante 11C09

4.3.1 Extração de DNA genômico do mutante 11C09

Para extrair o DNA genômico, utilizou-se como protocolo base a metodologia descrita por Sambrook, Fritsch e Maniatis (1989), a fim de isolar o DNA para o sequenciamento do gene mutado. Cultivou-se, em um erlenmeyr de 25 mL, 5,0 mL de meio de cultura NB com o mutante (11C09), mantido sob agitação constante de 200 rpm, a 28ºC, por 72h. Após esse período, a cultura foi centrifugada na centrífuga Eppendorf (5417R) por 2 min em tubos de centrífuga 1,5 mL até a formação de um precipitado compacto. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido com 567 µL de tampão TE 10:0,1. Adicionou-se SDS e proteinase K para uma concentração final de 0,5% e 100 µg/mL, respectivamente. Homogeneizaram-se as amostras e incubou-se a 37ºC por 1h. Após esse tempo, com a solução viscosa adicionou-se 100 µL de NaCl 5 M e, em seguida, 80 µL de solução CTAB/NaCl, incubando a 65ºC por 10 min. Nesse ponto, adicionou-se o mesmo volume de solução de clorofórmio/álcool isoamílico, centrifugando na velocidade máxima por 5 min na centrífuga Eppendorf (5417R). O sobrenadante aquoso/viscoso foi transferido para um novo tubo e, adicionando-se água estéril, foi novamente centrifugado. No novo tubo, adicionou-se um volume igual de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico e centrifugou-se na velocidade máxima por 5 min na centrífuga Eppendorf (5417R).

Transferiu-se o sobrenadante para um outro tubo e adicionou-se 0,6 volume de isopropanol para precipitar os ácidos nucléicos. O tubo foi agitado até a visualização de um DNA esbranquiçado. Centrifugou-se na velocidade máxima por 5 min, centrífuga Eppendorf (5417R), o sobrenadante foi descartado e o DNA foi seco em dissecador por 5 min. Fez-se a lavagem do DNA com etanol 70% para remover o CTAB residual, centrifugou-se novamente por 5 min e o DNA foi novamente seco em dissecador. O DNA foi ressuspendido em 80 µL de tampão TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM pH 8,0) com 1 µg/mL de RNAse e incubado a 37ºC por 1h. A qualidade do DNA foi verificada em gel de agarose 1% corado com 10 mg/mL de brometo de etídeo, com o tampão de corrida TBE 0,5X e a quantificação foi feita no NanoDrop® ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific).

4.3.2 Amplificação do DNA genômico do mutante 11C09

Os oligonucleotídeos direto (forward): 5´ ATGAAGTTGGAGGCGTTG 3´ e reverso (reverse): 5´ TTAGTGCAGCAACTCGGC 3´ foram utilizados para a amplificação e isolamento da ORF XAC1201, desde a metionina inicial até o códon

de terminação. As reações de PCR foram realizadas com 100 ηg de DNA genômico do mutante 11C09, 10 mM de cada oligonucleotídeo, 10 mM de dNTPs, 5U/µL de Taq DNA polimerase (Fermentas), 25 mM de MgCl2, 10X de tampão Taq, para uma reação com volume final de 50 µL. O termociclador GeneAmp® Thermal Cycler 9700 (Applied Biosystems) foi usado com o programa de desnaturação inicial de 94ºC por 1 min, seguidos de 35 ciclos de 94ºC por 30 seg, 60ºC por 30 seg e 72ºC por 2 min e uma extensão final de 72ºC por 10 min. A amplificação do gene foi confirmada por eletroforese em gel de agarose a 1% corado com 10 mg/mL de brometo de etídeo com o tampão de corrida TBE 0,5X e quantificado em NanoDrop® ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific).

4.3.3 Purificação do produto da PCR do DNA genômico do mutante 11C09

Como houve a presença de bandas múltiplas, foi necessário recortar do gel de agarose low melting (1%) a banda desejada com tamanho de 2.040 pb (819 pb da ORFXAC1201 e 1.221 pb do transposon Tn5). A banda recortada passou por uma desproteinização com fenol clorofórmio para a limpeza do DNA. Inicialmente o tubo de centrífuga 1,5 mL contendo o gel foi centrifugado à velocidade máxima por 2 min na centrífuga Eppendorf (5417R) e levado para banho-maria a 65ºC por 10 min. Centrifugou-se por 1 min na centrífuga Eppendorf (5417R) e adicionou-se 0,5 volume de fenol, agitou-se por 1 min e centrifugou-se por 5 min a 4ºC. O sobrenadante foi transferido para outro tubo e adicionou-se 0,25 volume de fenol e clorofórmio. Agitou-se por 1 min e centrifugou-se por mais 5 min na centrífuga Eppendorf (5417R). O sobrenadante foi recuperado e adicionou-se 0,10 volume de acetato de sódio e 2,5 volume de etanol absoluto. A amostra foi mantida em freezer de ultra baixa temperatura, a -80ºC por 20 min e, após esse período, centrifugada por 30 min na centrífuga Eppendorf (5417R). O precipitado foi ressuspendido em 1,0 mL de etanol 70% e centrifugado por 5 min. O sobrenadante foi descartado e o DNA seco em dissecador. Ressuspendeu-se o DNA em 10 µL de água estéril e quantificou-se em NanoDrop® ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific).

4.3.4 Sequenciamento do mutante

A presença do transposon dentro da ORF XAC1201 foi reconfirmada pelo sequenciamento da região de inserção do transposon Tn5. Como o transposon se encontra dentro do gene, foram sequenciadas as duas extremidades de DNA que o flanqueiam. Foram utilizados os seguintes oligonucleotídeos específicos: KAN-2 FP-1 Forward Primer 5' - ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC - 3' e KAN-2 RP-1 Reverse Primer 5' - GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAG - 3', que possuem

complementaridade de bases nas extremidades do transposon e direcionam a síntese no sentido externo ao transposon (LAIA, 2007). A reação de sequenciamento foi constituída de 1,0 µL de BigDye (Taq DNA polimerase, dNTPs com e sem fluorescência) v3.1 (Applied Biosystems), 3,0 µL de tampão SaveMoney, 1,0 µL de cada primer KAN-2 (FP-1 e RP-1) a 10 µM/µL, 2,0 μL de DNA a 50 ηg e 3,0 µL de água estéril para um volume final de reação de 10 µL. O termociclador PTC-100 Thermal Cycler (MJ Research) foi usado com o programa de desnaturação inicial de 96ºC por 1 min, seguidos de 39 ciclos de 96ºC por 15 seg, 52ºC por 15 seg e 60ºC por 4 min.

Após a reação, foi feita a preparação do DNA para o sequenciamento, adicionando 80 µL de isopropanol ao produto de PCR. Após 15 min à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas em centrífuga de placas Rotanta 46R (Hettich) a 3220 xg por 30 min a 20ºC. Após a precipitação do DNA, o sobrenadante foi descartado e as amostras foram lavadas duas vezes com 200 µL de etanol 70% seguido de centrifugação a 4.000 rpm por 10 min a 20ºC na centrífuga de placas Rotanta 46R (Hettich). As amostras foram secas a vácuo e, anteriormente ao sequenciamento, foi adicionado 10 µL de formaldeído para desnaturação e manutenção da fita simples. Foi utilizado o sequenciador automático ABI 3100 (Applied Biosystems) conforme metodologia sugerida pelo fabricante (LAIA, 2007).

As sequencias obtidas foram analisadas por bioinformática e alinhadas com o genoma de Xac para identificar a presença e a posição do transposon no gene mutado. O processo de alinhamento foi realizado por meio do algoritmo BLASTn.