RECONHECIMENTO DE DUAS ESPÉCIES CRÍPTICAS

Todas as análises filogenéticas com as 94 sequências da região mitocondrial COII de Heterotermes tenuis convergiram, com altos valores de suporte, quanto à monofilia de duas linhagens distintas dentro do que havia sido previamente identificado como H. tenuis (Ht. A e Ht. B, Figuras 2.1 e 2.2). Além disso, o fato das populações de Rondônia (simpátricas) de cada uma das duas linhagens terem se mostrado mais relacionadas com indivíduos geograficamente distantes (Ht. A agrupou indivíduos de Rondônia, do bioma Cerrado, e do Equador e Ht. B agrupou indivíduos de Rondônia, Manaus, AM e Guiana Francesa), fortalece a hipótese que se tratam de duas linhagens com histórias evolutivas independentes. Isto é, mesmo sobrepondo suas distribuições geográficas (em Rondônia, onde ambas são bem abundantes), Ht. A e Ht. B aparentemente não apresentam eventos de intercruzamento, preservando a estrutura genética adquirida por um isolamento anterior, seguido de especiação. Da mesma forma, a rede de haplótipos construída (Figura 2.3) isolou Ht. A e Ht. B, uma vez que a divergência genética entre esses dois grupos é superior a 10 passos mutacionais.

Esse tipo de abordagem, com a utilização de marcadores moleculares para delimitação de espécies, vem sendo bastante utilizada nas últimas décadas para diversos grupos (Hebert et al. 2003, 2004; Pons et al. 2006; Leaché & Fujita 2010), inclusive para cupins (Austin et al. 2005, 2007; Scheffrahn et al. 2005a, 2005b; Roy et al. 2006;

Hausberger et al. 2011). A técnica de DNA Barcoding, por exemplo, foi proposta com o intuito de realizar a delimitação de espécies utilizando-se apenas um marcador molecular. Desta forma, os proponentes dessa técnica argumentam que seria muito mais rápido realizar inventários biológicos e até mesmo descoberta de novas espécies (Hebert et al. 2003, 2004).

Segundo o que vem sendo utilizado pelas técnicas de DNA Barcoding e similares, os valores de Fst e distância genética altamente significativos encontrados entre Ht. A e Ht. B são evidências bastante consistentes a cerca da existência de duas espécies. Os adeptos dessas técnicas afirmam, por exemplo, que distâncias genéticas sob o modelo K2P maiores que 2% indicam divergências interespecíficas (Hebert et al.

2003, 2004), e aquela encontrada em Ht. A e Ht. B, foi de 5,8%. Da mesma forma, o gráfico com o número de diferenças par-a-par também mostra claramente o grau de divergência intra e inter específico de Ht. A e Ht. B (Figura 2.4), assim como a própria caracterização das sequências das duas espécies, onde mutações características de cada espécies podem ser claramente reconhecidas (Figura 2.5). Desta forma, poucas dúvidas existem acerca das evidências que o gene mitocondrial COII nos confere sobre a existência de duas espécies dentro do que havia sido previamente identificado como H.

tenuis.

Entretanto, a utilização de apenas um gene para realizar inferências sobre os limites interespecíficos é uma das críticas mais fortes à utilização de um procedimento similar ao DNA Barcoding. Eventos como hibridização, ocorrência cópias parálogas de genes, ou o separação incompleta de linhagens (imcompleate lineage sorting) podem afetar as análises, levando a inferências erradas acerca do limite de algumas espécies (Funk & Omland 2003; Elias et al. 2007; Mitchell 2008; Nicholls et al. 2012). Uma solução para esses problemas seria utilizar o maior número possível de evidências

possíveis, como por exemplo, regiões do DNA independentes, além de caracteres morfológicos, etológicos, fisiológicos, dentre outros (Dayrat 2005; Yeates et al. 2011).

Apesar dessas críticas sobre a técnica de DNA Barcoding e a utilização de marcadores moleculares para delimitar espécies (Moritz & Cicero 2004; Song et al.

2008; Lohse 2009), essas técnicas podem servir como ferramentas úteis para a taxonomia, como forma de auxílio aos estudos de morfologia e, especialmente, em casos como o reconhecimento de espécies crípticas (Dayrat 2005; Yeates et al. 2011).

Alguns estudos vêm indicando que existe uma grande quantidade de espécies que não são diagnosticáveis morfologicamente em diversos grupos de cupins (Roy et al.

2006; Szalanski et al. 2006; Austin et al. 2007; Hausberger et al. 2011). Com base em divergências do gene mitocondrial rRNA 16S, por exemplo, Szalanski et al. (2006) reportaram uma espécie críptica nos Estados Unidos, Reticulitermes okanaganensis.

Austin et al. (2007), utilizando o mesmo marcador molecular, somado a evidências de hidrocarboneto de cutícula e dados comportamentais, descreveram a espécie Reticulitermes malletei, também dos Estados Unidos.

Roy et al. (2006) encontraram quatro linhagens em Cubitermes sp. affinis subarquatus, sendo três delas simpátricas. Esses autores utilizaram tanto marcadores nucleares (ITS2) quanto mitocondriais (COII), e estes marcadores independentes foram concordantes em relação à existência das quatro linhagens. Hausberger et al. (2011), em um trabalho de diversidade genética em uma comunidades de cupins na África, destacam a importância de utilizar ferramentas moleculares para auxiliar a identificação de cupins. Estes autores também utilizaram tanto marcadores nucleares (28S) quanto mitocondriais (COI e COII), que concordaram quanto à existência de diversas espécies crípticas, especialmente dos gêneros Microtermes e Odontotermes (Macrotermitinae).

A concordância entre os genes mitocondriais e nucleares nos trabalhos de Roy et al. (2006) e Hausberger et al. (2011) não implica necessariamente que em Heterotermes ocorra o mesmo. Kutnik et al. (2004), por exemplo, em um trabalho de filogeografia de duas espécies de Reticulitermes na Europa, conseguiram diferenciar as duas espécies em questão através de hidrocarbonetos de cutícula e do gene nuclear ITS2, mas encontraram discordância desse resultado com as análises dos genes mitocondriais 16S rRNA e COII. Esses autores sugerem que essa divergência entre genes mitocondriais e nucleares teria sido devido a uma especiação parapátrica decorrente de eventos históricos de migração, e expansão / contração populacionais, durante as glaciações do Quartenário, quando refúgios foram formados no sul da Europa (Kutnik et al. 2004).

As evidências sobre o grau de diferenciação entre Ht. A e Ht. B também são encontradas através da utilização do relógio molecular relaxado, que aponta para uma divergência bastante antiga entre as duas espécies crípticas, tendo sido aproximadamente há 20 ± 8 milhões de anos, provavelmente no Mioceno (Figura 2.2).

Esse tempo de divergência está de acordo com o tempo de divergência encontrado entre algumas espécies de Reticulitermes na Europa (Velonà et al. 2010). Na Amazônia, rãs venenosas (Dendrobatidae) aparentemente apresentam divergências de linhagens datadas para o Mioceno (Santos et al. 2009). Após as incursões marinhas do Mioceno, por volta de 10 milhões de anos (Hoorn 1993; Silva & Garda 2010), as linhagens teriam dispersado da região dos Andes.

Vale resaltar que a biologia do gênero Heterotermes ainda é muito pouco conhecida se comparada com outros gêneros da mesma família. No gênero Reticulitermes, por exemplo, a biologia é extremamente flexível, com algumas espécies inclusive com sistemas de reprodução por partenogênese (Matsuura et al. 2009). Apesar de os dados de COII mostrarem que essas duas espécies não estão se intercruzando,

muito ainda é preciso se estudar para entender quais os mecanismos que os indivíduos de cada espécies utilizam para se reconhecer (e se evitarem) durante os eventos de intercruzamento.