Regeneração de gemas

O percentual de calos apresentando regeneração de gemas adventícias por organogênese in vitro e o número médio de gemas formadas por calo regenerado em explante foliar nos clones 1 e 3 encontram-se nas Figuras 8 e 9, respectivamente. Ressalta-se que o clone 2 não apresentou regeneração de gemas.

Conforme observado nas Figuras 8 e 9, os clones 1 e 3 apresentaram capacidade organogênica a partir de calos formados de explante foliar, indicando o potencial morfogênico desses materiais genéticos.

Observaram-se, nos três clones em estudo, mudanças quanto a coloração e textura dos calos durante a fase de regeneração em condições de luminosidade (Figura 10-A). Houve maior compactação na superfície dos calos e aumento significativo da estrutura nodular formada na região do pecíolo (Figura 10-B).

No clone 1, somente no tratamento T5 não foi observado regeneração de gemas, sendo o melhor resultado alcançado com a concentração de 1,0 mg L-1 de BAP (T4). Nesse clone, todas as gemas regeneradas nos tratamentos com BAP ou BAP e ANA se originaram na região do pecíolo formado pelo calo de aspecto nodular, sempre associadas à presença de antocianina.

BANDYOPADHYAY et al. (1999), trabalhando com Eucalyptus nitens e E.

globulus, observaram, em calos formados a partir de cotilédones, que, após os

tecidos serem transferidos para o meio de regeneração, eles se tornaram gradualmente mais compactos e nodulares, com formação das gemas adventícias nessas áreas.

Figura 8 - Percentual dos calos formados a partir de explantes foliares que regeneraram gemas, em função dos tratamentos com reguladores de crescimento (BAP e ANA) avaliado nos clones 1 e 3. Barras verticais indicam os desvios das médias.

Figura 9 – Número médio de gemas por calo formado a partir de explante foliar, em função dos tratamentos com reguladores de crescimento (BAP e ANA), avaliado nos clones 1 e 3. Barras verticais indicam os desvios das médias. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 TRATAMENTOS FREQÜÊNCIA DE _{REGENERAÇÃO (%)} 0 2 4 6 8 10 12 14 16 T 1 T 2 T 3 T 4 T 5 T 6 T 7 TRATAMENTOS FREQÜÊNCIA DE REGENERAÇÃO (%) CLONE 1 CLONE 3 0 1 2 3 4 5 6 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T R ATAMENTOS

NÚMERO DE GEMAS POR CALO 0

1 2 3 4 5 6 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T R ATAMENTOS

NÚMERO DE GEMAS POR CALO

Figura 10 - (A) organogênse de explante foliar nas fases inicial (1), de calejamento no escuro (2), na presença de luz (3) e de regeneração de gemas adventícias (4) do clone 1 após 35 dias. (B) Detalhe da estrutura nodular desenvolvida na região do pecíolo nas condições de regeneração das gemas adventícias. (C) Detalhe da regeneração do explante foliar desenvolvida na região do pecíolo.

HERVÉ et al. (2001) também observaram a correlação entre protuberâncias densamente coesas e a regeneração por organogênese em explante foliar de

Eucalyptus gunnii. Segundo esses autores, esses nódulos se formavam na parte

proximal ao pecíolo e, após serem excisados e transferidos para meio de regeneração, desenvolviam-se em gemas. Constataram, também, que os tecidos eram incapazes de regenerar gemas quando a parte proximal ao pecíolo da folha era removida.

A relação entre a presença de antocianina e a de organogênese foi relatada em trabalhos como o de MURALIDHARAN e MASCARENHAS (1987), que em explante foliar de E. camaldulensis verificaram que os calos formados desenvolviam antocianina e, após quatro semanas de cultivo, gemas iniciais se desenvolviam nessas áreas de pigmentação. SUBBAIAH e MINOCHA (1990), em trabalho com folhas e caule de E. tereticornis, observaram que os calos sempre se tornavam avermelhados antes do aparecimento dos primórdios de gemas. Também,

B A

C

1 2

CUENCA et al. (2000), na micropropagação por organogênese de Fagus sylvatica e

Fagus orientalis, relataram que nos calos formados os locais de diferenciação de

gemas eram aqueles que apresentavam antocianina.

Em relação ao clone 2, foi observada a presença de quantidades pequenas de antocianina na superfície de alguns calos, entretanto não houve regeneração de gemas nesses locais. Em todos os tratamentos com reguladores de crescimento na fase de regeneração de gemas, foi verificado crescente aumento no escurecimento do meio de cultura com o tempo, provavelmente pela liberação de compostos fenólicos.

O clone 3 apresentou, na região do calo formado por tecido nodular, gemas em estágio inicial de desenvolvimento, com a ressalva de que, na maioria dos casos, estas estavam associadas à presença de antocianina. Contudo, essas gemas não se desenvolveram quando subcultivadas em novo meio de regeneração ou alongamento.

A presença de antocianina foi também observada em alguns casos na superfície do explante, assim como no calo nodular desenvolvido na região do pecíolo, não estando, porém, associada a nenhuma estrutura. Uma percentagem dos calos, quando cultivados em meio de regeneração, tendeu a se oxidar após curto período em condições de luminosidade (31% em T1, 14% em T2, 36% em T3,11% em T4,21% em T5,13% em T6 e 18% em T7).

Diante desses resultados, com relação à capacidade organogênica a partir de explante foliar dos clones em estudo, os clones 1 e 3 responderam quando cultivados em meio de regeneração, sendo no clone 1 o melhor resultado obtido com 1,0 mg L-1 de BAP, em que 8% dos calos formados a partir de explantes foliares regeneraram gemas, com número médio destas formadas por calo igual a 4,2. No clone 3, o melhor resultado foi obtido com 0,5 mg L-1 de BAP e 0,2 mg L-1 de ANA, com número médio de gemas formadas por calo igual a 1. Em relação ao percentual de calos com regeneração de gemas, os valores obtidos foram inferiores aos resultados alcançados em trabalhos utilizando como fonte de explante material juvenil, como os de SUBBAIAH e MINOCHA (1990), TIBOK et al. (1995), AZMI et al. (1997) e BANDYOPADHYAY et al. (1999). Em relação a trabalhos em que

explantes foliares foram obtidos de clones de Eucalyptus, os resultados do presente estudo mostram-se inferiores aos alcançados por LAINÉ e DAVID (1994), que obtiveram 38,5% de calos regenerando gemas, porém próximos dos de HERVÉ et al. (2001), que obtiveram 8,8% de calos regenerando gemas com o número médio de gemas formadas por calo igual a 4.

Os regenerantes obtidos foram transferidos para meio de cultura, na busca do desenvolvimento das gemas adventícias para posterior enraizamento. Entretanto, dada a baixa taxa de regeneração, poucas gemas foram subcultivadas em meio específico, sendo a quantidade de gemas alongadas insuficiente para avaliar o potencial de enraizamento dos clones analisados.

4.3.2. Explante caulinar

O percentual de calos apresentando regeneração de gemas adventícias por organogênese e o número de gemas formadas por calo regenerado em explante caulinar nos clones 1 e 3 encontram-se nas Figuras 11 e 12, respectivamente. Ressalta-se que o clone 2 não apresentou regeneração de gemas.

Somente os clones 1 e 3 apresentaram alguma resposta de regeneração de gemas nos tratamentos com reguladores de crescimento. No clone 1, foi obtido resposta em somente 1% dos calos no tratamento T1, enquanto no clone 3 o melhor resultado foi conseguido no tratamento T4, com 5% dos calos formados a partir de explantes caulinares regenerando gemas.

Foram observadas, nos três clones, mudanças quanto a coloração e textura dos calos, após estes serem transferidos para o meio de regeneração e cultivados à luz. Os calos passaram a apresentar maior compactação e, de forma geral, coloração verde, cuja tonalidade variou de acordo com o clone.

Figura 11 - Percentual de calos com regeneração de gemas a partir de calos formados de explante caulinar, em função dos tratamentos com reguladores de crescimento (BAP e ANA), avaliado nos clones 1 e 3. Barras verticais indicam os desvios das médias.

Figura 12 – Número médio de gemas por calo regenerado em explante caulinar, em função dos tratamentos com reguladores de crescimento (BAP e ANA), avaliado nos clones 1 e 3. Barras verticais indicam os desvios das médias. CLONE 3 0 2 4 6 8 10 12 14 T 1 T 2 T 3 T 4 T 5 T 6 T 7 T R ATAMENTOS FREQÜÊNCIA DE _{REGENERAÇÃO (%)} CLONE 1 0 2 4 6 8 10 12 14 T 1 T 2 T 3 T 4 T 5 T 6 T 7 T R ATAMENTOS FREQÜÊNCIA DE REGENERAÇÃO (%) CLONE 3 0 1 2 3 4 5 6 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T R ATAMENTOS NÚMERO DE GEMAS POR CALO CLONE 1 0 1 2 3 4 5 6 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T R ATAMENTOS NÚMERO DE GEMAS POR CALO

Dos três clones em estudo, o clone 1 foi o que apresentou calos verdes com maior intensidade. Em alguns casos, foi observada a formação de estruturas nodulares compactas na superfície do calo, onde as gemas formadas no explante caulinar no tratamento T1 se desenvolveram a partir de regiões nodulares desse calo. Os calos que não apresentaram formação de gemas foram subcultivados em novo meio de regeneração, contudo, com o tempo, eles se oxidaram e morreram. Em relação ao clone 2, em todos os tratamentos com reguladores de crescimento na fase de regeneração de gemas foi observado crescente aumento no escurecimento do meio de cultura com o tempo, provavelmente pela liberação de compostos fenólicos. Dos calos que não se oxidaram durante o período até a avaliação, pequena parcela apresentou a coloração esbranquiçada, sendo a maioria de coloração esverdeada. Parte dos calos não oxidados desenvolveu estruturas nodulares compactas em sua superfície.

O clone 3, embora tenha sido o que melhor respondeu à organogênese em explante caulinar, teve percentual alto de calos oxidados ou em fase de oxidação quando foi realizada a avaliação (75% em T1, 80% em T2, 81% em T3,67% em T4, 83% em T5,83% em T6 e 80% em T7). As gemas produzidas, pouco desenvolvidas, formaram-se a partir de pequenas partes de tecidos nodulares compactos nos calos e apresentavam aspecto hiper-hídrico, estando em alguns casos associadas à antocianina (Figura 13). A relação entre a textura compacta e a capacidade de regeneração de gemas foi também observada por HERVÉ et al. (2001), que verificaram que calos formados a partir de segmentos internodais de clones de

Eucalyptus gunnii apresentavam, nas extremidades dos explantes, o

desenvolvimento de protuberâncias densas que culminavam na regeneração de gemas.

De acordo com os resultados, embora a taxa de oxidação no clone 3 tenha se mostrado alta, este apresentou a melhor “performance” na avaliação da capacidade organogênica a partir de calos formados em explantes caulinares quando cultivados em meio de regeneração com 1,0 mg L-1 de BAP. Vale salientar que os resultados obtidos em relação ao percentual de regeneração foram inferiores aos de

Figura 13 - (A) Organogênese em explante caulinar nas fases inicial (1), de calejamento obtido após 35 dias no escuro (2) e de regeneração de gemas adventícias do clone 3 obtida 35 dias após sua transferência para luz (3). (B) Detalhe das gemas adventícias desenvolvidas em explante caulinar, do clone 3.

SUBBAIAH e MINOCHA (1990), TIBOK et al. (1995), AZMI et al. (1997), BANDYOPADHYAY et al. (1999) e LAINÉ e DAVID (1994), sendo próximos dos resultados alcançdos por HERVÉ et al. (2001), que, utilizando segmentos internodais de clones de Eucalyptus gunnii, obtiveram 9,9% de calos regenerando gemas com o número médio destas formadas por calo igual a 3,4.

Os regenerantes obtidos foram transferidos para meio de alongamento, onde as gemas formadas, por serem pouco desenvolvidas e apresentarem hiper- hidricidade, não exibiram resposta no meio de alongamento.

Deve-se ressaltar que, na confecção dos explantes caulinares, principalmente quando estes não são realizados com o auxílio de lupa, existe a possibilidade de gemas axilares presentes ao longo das brotações permanecerem nos segmentos internodais utilizados como explantes, vindo, com isso, a mascarar os resultados obtidos. Portanto, explantes foliares se apresentam como fonte mais segura de explante.

A B

2

4.4. Análise histológica

As análises histológicas realizadas nos explantes foliar e caulinar revelaram a origem adventícia das gemas formadas.

Após 35 dias do início de cultivo para explante foliar em meio de regeneração, houve a diferenciação das gemas e primórdios foliares a partir da região proximal das folhas. Em toda a lâmina foliar houve a tendência de formação de maior ou menor índice de calejamento, de modo especial a partir de células do mesofilo junto à epiderme abaxial, permanecendo em alguns pontos intacta a epiderme adaxial. Nas regiões associadas aos feixes vasculares houve intensa atividade de divisão celular culminando na formação, em maior ou menor grau, de calos. À medida que se aproximava da região proximal das folhas houve tendência de formação de protuberâncias de aspecto nodular que culminaram, em alguns casos, na formação de gemas adventícias (Figura 14-A). Em ambos os clones, observou-se na extremidade distal dos explantes a diferenciação de gemas e primórdios foliares, seguindo o padrão típico de organogênese e apresentando a continuidade vascular com o tecido original (Figura 14-B). Pode-se observar, ainda, a presença de cavidades secretoras de óleo típicas da espécie (Figura 14-C).

Conforme observado nos regenerantes (Figura 10-A), as folhas em corte transversal apresentaram estrutura típica do gênero, sendo anfiestomáticas e apresentando mesofilo diferenciado, contendo este, cavidades secretoras (Figura 14- D).

Nos explantes caulinares, foi observada intensa divisão celular a partir da superfície de corte destes. Conforme descrito para os explantes foliares, as gemas diferenciadas apresentaram conexão vascular com o tecido original (Figura 14-E) confirmando, assim, a origem adventícia delas. Em corte transversal, houve intensa desdiferenciação de células a partir de células parenquimáticas associadas ou não à região vascular, resultando em considerável expansão radial dos explantes (Figura 14-F). De maneira semelhante, as células da periferia dos explantes apresentaram significativa divisão celular no plano predominantemente periclinal, contribuindo também para a expansão radial. Todavia, em algumas regiões dos explantes, houve

tendência de ocorrer a rediferenciação dessas células e a conseguinte formação de gemas (Figura 14-G).

A realização de análises histológicas em trabalhos com organogênese in vitro mostra-se fundamental para a confirmação da origem das gemas formadas em cultivo, excluindo a possibilidade de interpretação equivocada dos resultados advindos da presença de gemas pré-formadas no explante original.

Figura 14 - Fotomicrografias de cortes transversais (A, D e F) e longitudinais (B, C, E e G) de expantes foliar e caulinar. A – Formação de protuberâncias de aspecto nodular (PN) e gemas adventícias (GA) na região proximal do explante foliar. B – Continuidade dos feixes vasculares (FV) entre a região de formação do calo com gemas adventícias (GA) e primórdios foliares (PF). C – Presença de cavidades secretoras de óleo (CO). D – Folha de um regenerante apresentando estômatos (E) na epiderme abaxial (EPB) e cavidades secretoras de óleo (CO). E – detalhe da conexão dos feixes vasculares (FV) com gemas diferenciadas. F – Corte transversal evidenciando a proliferação celular e a conseguinte expansão radial (ER) do explante caulinar. G – Formação de gemas adventícias em explante caulinar (GA) apresentando conexão dos feixes vasculares (FV) com o tecido original do explante.

A PN GA B GA FV PF D E EPB CO F ER E FV C CO GA G FV GA

5. RESUMO E CONCLUSÕES

O presente estudo objetivou avaliar a micropropagação por organogênese em três clones de híbridos de Eucalyptus grandis x E. uorphylla, utilizando-se como explantes folhas e segmentos internodais de clones rejuvenescidos in vitro pela técnica de micropropagação via gemas axilares.

O presente trabalho foi constituído em duas etapas, sendo a primeira referente à produção das gemas alongadas in vitro para obtenção dos explantes foliar e caulinar e a segunda, às fases de obtenção de calos e regeneração de gemas adventícias. Os explantes foliar e caulinar foram cultivados em meio de cultura específico e submetidos a diferentes concentrações e tipos de reguladores de crescimento (TDZ, ANA e BAP).

Na fase de indução de calos, foram utilizadas quatro combinações dos reguladores de crescimento TDZ e ANA e quatro de BAP e ANA. Na fase de regeneração de gemas, o melhor tratamento para o calejamento foi repetido, sendo os calos obtidos avaliados em sete combinações com os reguladores de crescimento BAP e ANA.

De maneira geral, considerando as condições em que o experimento foi desenvolvido, obtiveram-se os seguintes resultados:

l Na fase de indução de calos, observou-se resposta diferenciada dos clones aos tratamentos com os reguladores de crescimento, tanto para explante

foliar quanto caulinar, em relação à quantidade, coloração e compactação dos calos.

l Nos três clones em estudo, na fase de calejamento, os melhores resultados foram observados com os reguladores de crescimento na combinação de 0,5 mg L-1 de TDZ + 0,1 mg L-1 de ANA, com 100% de calejamento. l Somente um clone apresentou capacidade organogênica com a utilização

de explante foliar, em que todas as gemas regeneradas nos tratamentos com BAP ou BAP e ANA se originaram na região do pecíolo formado pelo calo de aspecto nodular.

l Para explante caulinar, dois clones apresentaram resposta organogênica quando transferidos para meio de regeneração, com gemas formadas a partir de pequenas partes de tecido nodular compacto nos calos.

Com base nos resultados, pode-se concluir, com relação aos clones de

Eucalyptus grandis x Eucalyptus uorphylla avaliados, que os reguladores de

crescimento TDZ e ANA proporcionam maiores índices de calejamento, e a sua concentração variou de acordo com o clone utilizado. Contudo, a intensidade de calejamento não deve ser o único parâmetro na escolha de um tratamento objetivando a organogênese em Eucalyptus, sendo a textura do calo obtido fator de grande importância a ser considerado. De forma geral, entre os principais fatores envolvidos na organogênese, o tipo de explante, as condições ambientais, os meios de cultura e as combinações de reguladores de crescimento específicos para cada clone mostram-se necessários na obtenção de resultados satisfatórios na organogênese de clones de Eucalyptus.

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