Como na região promotora clonada foram encontrados motivos que, segundo o programa PLACE database, são responsíveis ao hormônio auxina, giberelina e ácido abscísico, foi montado um experimento in vitro onde plântulas (de três meses) crescidas em meio MS normal, foram transferidas para placas contendo meio MS suplementadas com o hormônio em estudo (25µmol/L) e a atividade GUS avaliada 3 dias depois.
Este experimento, semelhante ao anterior, foi realizado com o extrato protéico obtido das plântulas inteiras. A figura 24, mostra que os extratos das plantas tanto do controle negativo quanto do positivo não respondem a estes tratamentos hormonais. Por outro lado, uma resposta significativa aos hormônios auxina, citocinina e giberelina foi observada em todas as construções (GUS 2, GUS 3 e GUS 4). Entretanto, a construção GUS 2, não mostrou-se tão responsível aos hormônios auxina e citocinina como fizeram as construções GUS 3 e GUS4. Este resultado, confirma os dados disponibilizados pelo
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programa de predição. A região regulatória usada na construção GUS2, segundo este programa, não apresenta motivos que são conhecidamente responsíveis a estes hormônios. Diferentemente, as regiões regulatórias que foram usadas nas construções GUS 3 e GUS 4, apresentam o motivo em cis "TATTTGCTTAA" que segundo Nagao e colaboradores, (1993) é reconhecidamente um motivo responsível à este hormônio de crescimento.
Entretanto, para estabelecer se a FtsH-p1 de tomate é um elemento da resposta primária ou secundária da auxina necessita-se realizar novos experimentos onde a expressão temporal deve ser acompanhada não apenas e um único ponto (3 dias após a transferência para o meio contendo o hormônio) mas sim, desde o momento em que foi estabelecida a transferência do meio de crescimento. Segundo Abel & Theologis (1996), a cascata de sinalização que se inicia após a percepção do hormônio vegetal auxina gera, em questão de minutos, aumento ou diminuição da expressão gênica de muitos genes (genes de resposta primária=auxin/IAA) sem que haja a necessidade da síntese de novas proteínas. Posteriormente, a nova rota de regulação iniciada por esses genes, segundo dados mais recentes (Zenzer et al., 2001), coloca a regulação proteolítica como um paradigma emergente na via de sinalização da auxina. A remoção de reguladores por proteólise é um método bastante rápido e irreversível de eliminar suas atividades, e aparentemente, é o utilizado por esse hormônio vegetal. Sendo assim, podemos especular que a FtsH-p1 seria um dos componentes utilizados pela via de resposta à auxina no processo de degradação de seus potenciais substratos, no interior de cloroplastos.
Por outro lado, não encontramos (dados disponibilizados pelo programa de predição) nenhum motivo que seria responsível ao hormônio citocicina. O aumento observado da expressão da atividade GUS em resposta a este hormônio, poderia ser explicada devido ao conhecido efeito sinergístico que ocorre entre os hormônios auxina e citocinina (Coenen & Lomax, 1998). Sabe- se, que após a exposição de tecidos foliares à soluções de citocininas, ocorre elevação de auxinas livres no interior de suas células. Assim, pode ser que o
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aumento na atividade GUS detectada nos tecidos das plantas transgências contendo as construções GUS 3 e GUS 4 na presença de citocinina seja explicada pelo aumento nos níveis endógenos da auxina.
a)
b)
Figura 24 - a) Quantificação da atividade GUS em plântulas transgênicas de tabaco contendo as diferentes construções expostas a diferentes hormônios. As barras representam a média e o desvio padrão de 10 plantas. b) Detecção da atividade de GUS em plântulas transgênicas (GUS4) realizada pelo ensaio histoquímico.
0 500 1000 1500 2000 2500 35S- GUS
GUS1 GUS2 GUS3 GUS4 VETOR
pmol/mgProt/min
MS MS+AUX MS+GIB MS+CIT MS + ABA
MS MS+A MS+G MS+C MS+ABA
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Contrariamente, na seqüência regulatória da FtsH-p1 foram encontrados motivos que foram reportados como sendo regulados por ABA (CATGCA) (Ezcurra et al., 1999). Entretanto, os dados de expressão GUS indicam que a concentração do hormônio utilizada (25µmol/L) não foi capaz de promover a expressão do gene. Ou ainda, apesar de apresentar um motivo aparentemente relacionado à expressão de genes induzidos por ABA, esta sequência cis per se não é suficiente para promover a expressão heteróloga do gene em questão. Uma outra possibilidade, é que uma sequência mais à montande da utilizada nos experimentos seja importante na ativação do gene. Porém, este resultado está em concordância com o obtido por Ivashuta e colaboradores (2002) que mostraram, utilizando a metodologia Northern Blot, que a FtsH-p1 de alfafa não apresenta regulação positiva nem negativa quando na presença deste hormônio. Conforme mencionado anteriormente, estes resultados precisam ser interpretados com cautela uma vez que experimentos adicionais tais como Northern e Western Blot são imprescindíveis para valorização dos dados aqui apresentados.
Como comentado anteriormente e visível na figura 24, diferente dos outros tratamentos, a resposta ao hormônio giberelina (GA3) deu-se já com a construção GUS2. Analisando os dados provenientes da análise efetuada in silico, encontramos na sequência regulatória utilizada nessa construção a existência de um motivo (TTTTTTCC=PYRIMIDINEBOX) que segundo Cercos e colaboradores (1999), trata-se de um elemento em cis envolvido nessa resposta. Os dados obtidos com os hormônios auxina e giberelina, condizem com o que relata a literatura. Novas interações entre os hormônios clássicos são descobertas a todo momento (Ross & O´Neill, 2001). Auxina e giberelina, são requeridos para manter o crescimento e elongação de caules, e recentemente, Ross e colaboradores (2000) mostraram que a auxina esta envolvida na promoção da biossíntese da giberelina ativa cujos passos iniciais ocorrem no interior de plastídios. Essa recente descoberta mostrou um novo elo nas interações entre esses dois hormônios responsável por desencadear uma
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grande variedade de respostas envolvidas no desenvolvimento vegetal. Entretanto, dados adicionais seriam essenciais para tentar decodificar a rota estabelecida no processo de ativação da FtsH-p1 por esses hormônios. Se na região regulatória do gene FtsH-p1 de tomate se associam fatores transcricionais (fatores em trans) hormônios específicos, isto é, se são rotas completamente independentes, ou se existe interação sinergística entre esses fatores são dados que merecem ser estudados futuramente.
Certamente, as interações hormonais podem ser dramaticamente afetadas pelo tipo de órgão em questão (Ross & O'Neill, 2001). Sendo assim, a fim de verificar a existência de uma interação entre regulação tecido-específica e resposta hormonal, foram analisados diferentes tecidos (folhas e caules) das plantas pertencentes à construção que apresentou maior resposta aos hormônios (GUS4) e os dados obtidos estão sintetizados na figura 25.
Percebe-se que os tecidos foliares e os tecidos caulinares responderam (aumento da expressão GUS) positivamente aos hormônios analisados, quando comparados aos tecidos que estavam em meio MS. A regulação positiva gerada pela presença destes hormônios, pode estar associada ao papel das FtsHs no interior dos cloroplastos e plastídios. Além de estar envolvida no processo de degradação da proteína D1 do fotossístema II após dano fotooxidativo, esta proteína poderia estar envolvida no processo de remanejamento de membranas no interior destas organelas (Sakamoto et al., 2002). A partir de estudos fisiológicos e bioquímicos, sabe-se que estes hormônios desencadeiam uma cascata de sinalizações que, na maior parte das vezes, ativam o processo de divisão, elongação e crescimento celular (Zenzer et al., 2001). Sendo assim, na presença destes hormônios, é importante que a cascata de sinalização ative genes que são responsáveis pelo crescimento e remanejamento de membranas porque novas organelas devem ser rapidamente produzidas. A interpretação mais aprofundada destes dados passa por um melhor entendimento da função das FtsHs nos cloroplastos, além da identificação de substratos destas proteases. Entretanto, caso os dados sejam
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confirmados por Northern e Western blot, novas perspectivas relacionadas ao papel das FtsHs e sua regulação são trazidos a tona baseados no controle sua expressão por hormônios.
Figura 25 - a) Quantificação da atividade GUS tecido específica em plântulas transgênicas de tabaco (GUS4). As barras representam a média e o desvio padrão de 10 plantas. b) Detecção da atividade de GUS em plântulas transgênicas (GUS4) realizada pelo ensaio histoquímico.