3. Materiais
4.5. Caracterização físico-química das nanopartículas (SLN e NLC)
4.5.8. Ressonância paramagnética eletrônica (RPE)
A ressonância paramagnética eletrônica é uma técnica espectroscópica que opera na região de microondas (faixa de 9 a 10 GHz) e consiste em detectar, de maneira indireta, um ou mais elétrons desemparelhados (transições de estados de spin eletrônicos) de compostos químicos (moléculas paramagnéticas) que, ao serem submetidos a um campo magnético, reorientam seus spins eletrônicos de acordo com seus momentos magnéticos de spin (Knowles et al., 1976 e Marsh, 1981).
A precessão do spin eletrônico ocasionada pela adição de uma onda magnética ressonante promove absorção de energia e transição do estado de spin. A energia correspondente a essas transições é da ordem de grandeza daquela envolvida em movimentos translacionais, rotacionais e segmentares das moléculas, o que permite a análise desses movimentos através dos espectros obtidos.
A Equação 9 pode ser utilizada para discutir a técnica de RPE, onde:
H g
hv
Equação 9 onde, h=constante de Planck; v= frequência da radiação incidente; g=fator característico do elétron ; =magneton de Bohr ; H=campo magnético externo.
Geralmente a frequência da radiação incidida na amostra é mantida constante e o espectro de absorção é determinado em função do campo magnético externo variável. O espectro de RPE é registrado como a primeira derivada da curva do espectro de absorção (Knowles et al., 1976; Schreier et al., 1978; Marsh, 1981). Após algum tempo há relaxação e retorno ao estado de spin original.
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O radical nitróxido (Figura 14) é marcador de spin mais utilizado por ser estável em amplas faixas de temperatura e pH. Nele, o momento magnético do elétron desemparelhado interage com o campo magnético externo e com o momento magnético nuclear do nitrogênio (I = 1). Essa última interação é chamada de interação hiperfina e possibilita desdobramentos dos níveis de energia (Knowles et al., 1976; Schreier et al., 1978), responsável pelos 3 picos característicos do espectro do nitróxido. A anisotropia espectral é dependente da orientação do eixo molecular do radical nitróxido em relação ao campo magnético e reflete a mobilidade desse marcador de spin, quando incorporado em sistemas orientados. Portanto, através dos espectros de RPE é possível monitorar a viscosidade e/ou a ocorrência de interações no ambiente onde se encontra o marcador de spin. Marcadores do tipo ácido n - doxil esteárico se intercalam e orientam-se com o eixo z do radical nitróxido aproximadamente paralelo ao eixo normal da bicamada (Marsh, 1981), em membranas modelo e biológicas.
COOR
O N O-
R= H-5-SASL R= CH3-5MeSL
Figura 14. Estruturas químicas dos marcadores de spin contendo o grupo paramagnético nitróxido: 5-doxil ácido esteárico (5-SASL), e éster metílico do 5-doxil ácido esteárico (5-MeSL).
A partir de espectros de RPE é possível calcular o parâmetro de ordem (S), que é uma medida da anisotropia do ambiente em que se encontram as moléculas do marcador de spin. O espectro desses marcadores apresenta parâmetros que refletem as orientações nos eixos x, y (extremos internos) e z (extremos externos) que são usados para a determinação de S (Figura 15).
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Figura 15. Espectro de RPE do marcador 5-SASL em lipossomas (A) (Schreier et al., 1984) e nanopartículas lipídicas sólidas (B).
O parâmetro de ordem é uma medida da orientação da molécula em relação ao eixo diretor (normal à bicamada lipídica) e varia de 0, em sistemas isotrópicos a 1, para uma molécula perfeitamente orientada (Jost et al., 1971). S reflete a amplitude angular do movimento anisotrópico da molécula e pode ser calculado pela Equação 10, a qual relaciona os parâmetros determinados a partir dos espectros experimentais.
2
//
Ayy
Axx
Azz
A
A
S
Equação 10 onde, A// e A são medidos diretamente no espectro de RPE. Azz, Axx e Ayy são os principais componentes do tensor hiperfino, medidos em monocristal, e tem os valores constantes de 32, 6 e 6, respectivamente (Schreier et al., 1978).Em membranas, se o grau de ordem da bicamada é pequeno, os extremos externos do espectro não são resolvidos e o parâmetro de ordem não pode ser medido diretamente. Este é, em geral, o caso dos metil estearatos, que não interagem
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fortemente com a interface aquosa da membrana por não possuírem um grupamento carregado para ancorar-se ao nível da cabeça polar dos lipídios. Pela falta de uma forte interação, o espectro dos MESL mostra um baixo grau de anisotropia, o que impede tanto a medida do parâmetro de ordem, como o cálculo preciso do tempo de correlação rotacional da molécula, empregando a teoria desenvolvida para sistemas isotrópicos (Schreier et al., 1984). Neste caso pode-se acompanhar a razão das alturas dos picos de campo baixo (h+1) e médio (h0), o que indica uma medida do grau de organização da membrana; este parâmetro resulta da contribuição da orientação e da mobilidade rotacional dos marcadores de spin inseridos na bicamada (Schreier et al., 1978).
Quanto mais anisotrópico o movimento do marcador incorporado na nanopartícula, mais alargadas as linhas espectrais e, consequentemente, maior é a diferença entre os picos de campo baixo (h+1) e médio (h0), enquanto uma menor organização no ambiente ao redor da sonda é acompanhada por razões h+1/h0 maiores.
As medidas de RPE foram conduzidas no Instituto de Física da USP, Laboratório de Biofísica sob responsabilidade da Profa. Dra. Teresa Lammy com o auxílio técnico - científico do Dr. Evandro Luis Duarte, em espectrômetro Bruker EMX em banda-X operando em frequência de 10 GHz.
As amostras de SLN e NLC foram marcadas utilizando marcadores de spin do tipo nitróxido-ácido esteárico e nitróxido-metil ácido esteárico (5-SASL ou 5-MeSL, SIGMA, EUA), de forma a obter uma concentração final de aproximadamente 1 mol% de marcador de spin (em relação à concentração total de lipídios da formulação), incubados por aproximadamente 30 min a 37 ºC. Alíquotas das amostras marcadas foram colocadas numa cavidade ressonante retangular, com controle de temperatura realizado por um dispositivo de temperatura variável Bruker BVT-2000. Os espectros de RPE foram inicialmente obtidos a 25 °C para as SLNMM e NLCMM com e sem DBC, e no intervalo de 5 °C a 55 °C para as SLNMM e SLNCP com e sem DBC preparadas por HP. O grau de organização foi analisado principalmente pela alteração dos parâmetros de ordem (S) e empírico h+1/h0 (de Paula & Schreier, 1995).
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