Resultado por sequenciamento de nova geração para amostra de lodo de esgoto

O sequenciamento por MiSeq da amostra de RNA de lodo de esgoto ativado extraído com o protocolo G, gerou um total de 1.8 milhões de reads, no qual atingiram a qualidade de leitura em 84%. Cerca de 51% do total de reads foram caracterizados em nível de espécie (Figura 46). De todas as reads identificadas, 86,4% pertenciam ao reino bactéria e 11,2% ao reino vírus.

Figura 45- Total de sequências identificadas em níveis de classificação taxonômica para a amostra de

RNA de lodo ativado.

A análise por metagenômica da amostra de RNA de lodo ativado mostrou a predominância do filo Proteobacteria (Figura 47, A), apresentando como classes dominantes a Alphaproteobacteria e a Betaproteobacteria com 26% e 20% respectivamente (Figura 47, B). Dentre as Alphaproteobacterias, a Rhizobiales foi a ordem que apresentou maior representatividade com 13% do total de reads, seguido pela Burkholderiales (10%) e a Rhodocyclales (8%), ambas pertencentes a classe Betaproteobacteria (Figura 47, C). A família de maior representatividade foram as Comamonadaceae e a Rhodocyclaceae (ambas com 8% do total de reads; Figura 47, D). Apesar da ordem Rhizobiales ter sido o grupo mais representativo, o membro de maior representação foi o Beijerinckiaceae com somente 4% do total de reads (Figura 47, D).

Na comparação dos resultados obtidos entre a metagenômica (Figura 48 A e B) e pela técnica de ARDRA, podemos notar que os membros da classe Alphabacteria não foram observados nos sequenciamentos dos indivíduos agrupados por ARDRA (Tabela 12). Sendo que, para ambos dos experimentos realizados para lodo ativado, foram utilizadas alíquotas pertencentes a mesma amostra. Fredriksson (2013) observaram que, as classes Alphaproteobacteria e Betaproteobacteria são abundantes em lodo ativado. E que os conjuntos de iniciadores denominados “universais” utilizados na PCR afetam substancialmente a comunidade bacteriana, distorcendo o resultado em relação à estrutura, função e dinâmica da comunidade. Ainda é comumente observado o uso de somente um único par de iniciadores em pesquisas com amostras ambientais. Além disso, comparações empíricas indicam

1,807,876 1,760,369 _1,709,089 1,650,088 _1,598,086 1,460,772 956,692 0% 20% 40% 60% 80% 100%

Reino Filo Classe Ordem Família Gênero Espécie

To tal d e R ead s C las si fi cad o s Nível Taxonômico

que não há um par de iniciadores melhor que outro, sendo necessário determinar qual conjunto de iniciador é o mais adequado para cada amostra ambiental (FREDRIKSSON, et al., 2013; SÁNCHEZ, et al., 2007). Starke (2014) concluiram que, a escolha dos iniciadores pode afetar severamente os resultados obtidos por metagenômica, sendo necessário o uso de mais de um par de iniciador para a completa cobertura da diversidade bacteriana em amostras complexas.

O uso dos iniciadores 338F1, 338F2,338F3 e 909R (PINTO; RASKIN, 2012) possibilitou uma cobertura mais abrangente para a amostra de lodo para o filo de maior dominância (Proteobacteria) em comparação ao uso dos iniciadores 27F e 1401R. Dentre as espécies de maior representatividade por metagenômica e pré- processados pelo software 16S Metagenomics App estão a Magnetospirillum bellicus, a Methylocella silvestris e a Dechloromonas hortensis (todas com 2% do total de reads; Figura 48, B).

A

B

C

D

Figura 46- Classificação taxônomica em níveis de filo (A), classe (B), ordem (C) e família (D), obtidos para amostra de lodo ativado pel o software 16S

Figura 47- Classificação taxônomica em níveis de gênero (A) e espécie (B), obtidos para amostra

de lodo ativado pelo software 16S Metagenomics App. (*) Conjunto das classificações abaixo de 3% de abundância.

Ao comparar a abundância somente das espécies obtidas pela técnica de ARDRA (Figura 49 A) com o 16S Metagenomics App (Figura 49 B), foi observado que para ambas das técnicas de identificação utilizadas, as espécies com maior representatividade foram a Dechloromonas hortensis e a Zoogloea caeni. Apesar do resultado de metagenômica ter sido gerado pelo software 16S Metagenomics App, o alinhamento de sequências de RNA requer um pré-tratamento manual com o intuito de melhorar a precisão na análise comparativa com os bancos de dados utilizados (GARDNER, 2012).

Figura 48- Comparação da abundância de espécies obtidas pela técnica de ARDRA (A) e 16S

No resultado obtido para a amostra de RNA de lodo ativado utilizando o QIIME + SILVA (97% de identidade), podemos notar uma redução considerável de OTUs de menor representatividade (outros) tanto em nível de família quanto em gênero (Figura 50 A e B). Mostrando que o uso de filtro de qualidade durante a análise dos dados é imprescindível para melhorar a resolução dos resultados e a profundidade de identificação taxonômica. Foi observado a predominância do gênero Acinetobacter (10%), os membros desse grupo possuem características de oxidase negativa, aeróbias estritas e acumuladoras de fosfato, sendo normalmente encontrados em lodo ativado (CARR, et al., 2003; KIM, et al., 1997). Membros pertencentes a este gênero possuem a capacidade de produzir EPS, contribuindo para a formação da estrutura do biofilme (BADAVE; DHANANJAY, 2015; JANG et al., 2016; MEROD; WUERTZ, 2014). Também foi observado que os grupos de maior representatividade nos resultados obtidos por ARDRA e pelo software 16S Metagenomics App (Figura 50 A e B) permaneceram presentes na análise por QIIME+SILVA (97%; Figura 50 B).

Na comparação dos resultados obtidos para a amostra de RNA de lodo ativado utilizando o QIIME + GreenGenes 97% e 99% de identidade (Figura 51 A e B, respectivamente) foi observado dominância de membros da família Comamonadaceae, seguido dos gêneros Acinetobacter, Dechloromonas e Zoogloea.

Figura 49- Classificação taxônomica em níveis de família (A) e gênero (B), obtidos para amostra de

lodo ativado (Protocolo G) por metagenômica e pré-tratamento QIIME + SILVA (97%). (*) Conjunto das classificações abaixo de 3% de abundância.

Figura 50- Classificação taxonômica em nível de gênero obtidos para amostra de lodo ativado (Protocolo G)

por metagenômica e pré-tratamento QIIME + GreenGenes 97% (A) e 99% (B) de identidade. (*) Conjunto das classificações abaixo de 3% de abundância.

Bactérias quimio-organo-heterotróficas constituem a maior população em lodo ativado, especialmente os membros pertencentes à família Comamonadaceae. E dentre as bactérias denitrificantes a Aquaspirillum, Azoarcus, Thaurea e Zoogloea spp. são as espécies que predominam no lodo ativado. As bactérias redutoras de ferro, sulfato redutoras, acumuladoras de fosfato, metanotróficas, acumuladoras de glicogênio, nitrificantes e oxidante de enxofre são grupos também encontrados em sistemas de lodo ativado. Bactérias que pertencem ao gênero Zoogloea desempenham um importante papel na formação do floco. Entretanto, apesar do domínio desse grupo em algumas estações de tratamento, existem outros formadores de micro-colônias. Membros da família Comamonadaceae podem produzir EPS, como observado para as espécies Comamonadaceae testosteroni e Acidovorax temperans, ambas encontradas em lodo ativado (EHLERS, 2013; HEIJSTRA, 2010). O EPS tem uma função importante retenção de íons de metais pesados no tratamento de águas residuais e apesar da baixa produção de EPS pela Acidovorax temperans cultivada em laboratório, é possível que em lodo ativado a produção seja maior, contribuindo com a retenção de metais. A composição monossacarídica do EPS pode ser altamente variável entre as espécies formadoras de biofilme, essa variação também pode ocorrer entre cepas de uma mesma espécie em relação as condições do ambiente. A espécie Acidovorax temperans também produz DNA extracelular, no qual é utilizado como elemento estrutural na formação do biofilme. Acreditava-se que, o DNA extracelular encontrado em flocos de lodo ativado era proveniente somente da lise celular, entretanto essa molécula possui função estrutural no biofilme (HEIJSTRA, 2010; SEVIOUR; NIELSEN, 2010).

Em lodo ativado não há somente uma espécie capaz de acumular fosfato (OAF – organismos acumuladores de fosfato), estudos sugerem que bactérias pertencentes aos gêneros Dechloromonas, Acidovorax, Zoogloea, e Acinetobacter, possuem essa capacidade metabólica (KAMIKA et al., 2014; OSHIKI, et al., 2008; TU; SCHULER, 2013). Entretanto, Dechloromonas spp. possuem o comportamento de acumular fosfato somente na condição com disponibilidade de nutriente (SEVIOUR; NIELSEN, 2010).

5.5.2 Estimativa de abundância de espécies por sequenciamento de nova geração