Resultado sorológico indeterminado pela IF

Ao avaliar o desfecho dos cães com resultado sorológico indeterminado na IFI registrou-se proporção menor no estudo transversal quando comparada às etapas subsequentes do estudo de coorte. Foi constatada a soroconversão em 12,1% dos cães ao final do estudo. A maioria negativou e 8,1% mantiveram o resultado indeterminado. Os cães que morreram antes de nova coleta de sangue tiveram a mesma proporção (12,1%) dos animais que soroconverteram e em outros 23,2% não foi possível realizar a coleta de sangue por

motivos diversos (recusa, casa fechada, endereço não encontrado, etc).

Em Belo Horizonte, foi constatada soroconversão de resultado indeterminado na IFI em 38,36% dos cães acompanhados no período de 1999 a 2003 (Lopes et al., 2005); aumentando para 81,7% neste município no período de 2006 a 2010 (Menezes, 2011) e de 54,3% na regional noroeste deste município de 2006 a 2011, ocorrendo em 104 dias em média e com mediana de 54 dias (Gonçalves, 2013). O não monitoramento destes cães implica na permanência de um quantitativo expressivo deles no campo como reservatório da doença. Fato este preocupante por ser o cão apontado como o mais importante reservatório devido ao intenso parasitismo cutâneo e grande número de casos de LVC (Abranches et al., 1991).

Autores sugerem que em casos de resultados negativos ou mesmo discordantes entre ELISA e IFI, o método parasitológico com uso da imuno- histoquímica deve ser empregado devido à baixa sensibilidade destes testes sorológicos, especialmente em cães assintomáticos (Queiroz

et al., 2010). Outros autores alertam para o

monitoramento, também, dos cães com PCR positiva devido à possibilidade de soroconversão, detectada precocemente pelo método molecular quando comparado ao sorológico utilizado na rotina, também com destaque para os cães assintomáticos (Coura-Vital et al., 2013). Esta técnica tem se aprimorado e difundido por ser comprovadamente mais sensível, sendo eleita para o diagnóstico da LVC, mas ainda necessita ser menos onerosa e estar padronizada pelo MS para inquéritos epidemiológicos (Queiroz et al., 2010).

Este amplo espectro de variações no resultado da IFI entre intervalos semestrais reforça a complexidade do diagnóstico sorológico atrelado tanto à qualidade do kit, ao rigor na execução da técnica, como também aos níveis de anticorpos detectáveis diretamente ligados ao tipo de resposta imunológica expressa pelo cão, além da possibilidade de reações cruzadas com outras doenças, como LTA, Chagas e erliquiose (Ferreira et al., 2007). Autores observaram cão assintomático com IFI positiva sem confirmação da LV pelos testes parasitológico e molecular (Dias et al., 2010). No acompanhamento dos cães com IFI indeterminada, foi observado que a

maioria destes animais nas duas primeiras etapas e praticamente a metade na terceira etapa não apresentou sinal clínico sugestivo de LV, o que dificulta a concordância do diagnóstico pelas diferentes técnicas disponíveis, assim como o inverso também é verdadeiro.

É importante ressaltar que a qualidade do kit utilizado sofreu variações nos diversos lotes repassados pela FIOCRUZ. Coincidentemente, nas duas últimas etapas com maior frequência de resultados indeterminados houve devolução de kit de IFI à FUNED por má qualidade, o que foi confirmado por este laboratório de referência nacional. Algumas amostras reenviadas à instituição para controle de qualidade apresentaram resultados divergentes.

Morais (2011) identificou grande discordância entre as técnicas utilizadas nos inquéritos caninos em Belo Horizonte, com quantitativo de 190.000 cães analisados em média anualmente.

Como o objetivo deste estudo de coorte foi avaliar a soroconversão dos animais, além do rigor na padronização de todos os procedimentos da técnica de IFI, também a execução do teste e uma das leituras realizadas nas lâminas de microscopia foram todas feitas por uma profissional bioquímica. No caso de divergência na leitura havia discussão do grupo técnico e em alguns casos optava-se por repetir a análise. Em relação ao resultado de ELISA feito em paralelo com a IFI observou-se que a minoria apresentou resultado também indeterminado (14,9%), a metade foi de resultado positivo e 35,1% de negativo. Ao se avaliar unicamente os cães com resultado de IFI indeterminada e que se soroconverteram na etapa seguinte, constatou-se o resultado de ELISA diversificado chegando a apresentar negatividade na maioria dos cães. Ou seja, nestes casos a IFI mostrou maior sensibilidade que o ELISA na detecção precoce de títulos de anticorpos. Quando, porém, houve a soroconversão e a IFI foi positiva o ELISA, também, foi positivo em 91,7% dos casos. Uma possível explicação seria o aumento no título de anticorpos decorrido o tempo entre as análises laboratoriais.

Dentre as amostras enviadas à FUNED para controle de qualidade foram priorizadas as que apresentavam IFI indeterminada e reagente com

diluição de 1:40. Das amostras com resultado indeterminado registrado pelo Laboratório de Leishmanioses da EV-UFMG 64,2% participaram do controle de qualidade, ou seja, mais da metade. Os resultados liberados pelo laboratório de referência nacional (FUNED) para o diagnóstico da LV concordaram com a IFI indeterminada em 40,0% das amostras, do restante 56,8% foram negativas e 3,2% soropositivas.

Destas soropositivas na FUNED e com resultado indeterminado no laboratório universitário, uma amostra foi da 2ª coleta e apresentou resultado negativo em ambos laboratórios na 3ª coleta; outras duas amostras foram positivas na 3ª coleta mas não foram consideradas para emissão de laudo como soropositivo por não terem apresentado nem um sinal clínico nas três etapas do trabalho e terem apresentado todos os resultados negativos no ELISA e IFI nas etapas anteriores, pelo laboratório universitário. De maneira geral, o resultado da FUNED foi considerado oficial para liberação do laudo, com poucas exceções como nestes casos. Este evento exemplifica a dificuldade de se trabalhar com títulos próximos ao ponto de corte, possíveis de alterações metodológicas intra e interlaboratoriais. No caso da IFI foi usado o mesmo kit procedente de Bio-Manguinhos e com lotes variados.

Assim como o título da IFI em humanos foi alterado da diluição de 1:40 para 1:80 (Manual..., 2003) o título considerado ponto de corte para a LVC deveria ser reconsiderado pelo PCLV. Existem outras lacunas que poderiam ser priorizadas, como o uso de técnicas de diagnóstico mais sensíveis e específicas, intensificação nos estudos entomológicos para combate ao vetor, maior agilidade entre diagnóstico e ações sequenciais no campo.

Em estudo comparativo da proporção de resultado indeterminado entre laboratório universitário e municipal observou-se maior proporção no laboratório universitário de 13,1%, enquanto o municipal apresentou taxa de 2,5%. Os autores destacaram a importância da maior permanência dos cães com o resultado indeterminado culminando na manutenção da doença (Lopes et al., 2008). Machado (2004) comparou os resultados sorológicos (ELISA e IFI) da LVC entre cinco dos oito laboratórios em

Belo Horizonte que o realizavam e encontrou alto grau de concordância entre eles. No entanto, as amostras apresentaram maior frequência nos títulos de 320 a 1280, o que favorece a maior concordância entre laboratórios, uma vez que os títulos menores, principalmente de 40 e 80 são os que causam maiores divergências.