Resultados adicionais

Conforme mencionado anteriormente, este trabalho foi submetido ao periódico

Autophagy e dentre os pontos levantados pelos revisores estão as seguintes

sugestões: 1. Mostrar a utilidade do método para avaliação da indução de autofagia em células primárias; 2. Demonstrar as reais vantagens da abordagem proposta para quantificação, separando células de maior e menor atividade autofágica pela marcação com AO, e comparar entre essas populações as diferenças entre autofagossomos e autolisossomos por microscopia eletrônica.

Os resultados parciais para responder essas questões estão apresentados a seguir e após finalizados serão incorporados ao manuscrito para ressubmissão para a mesma revista.

i. Detecção da indução de autofagia em culturas primárias pela marcação com AO

Para abordar a questão da validade da marcação com AO para detectar indução de autofagia em culturas primárias, foram utilizados fibroblastos isolados de pele e de pulmão de rato Wistar adulto e células tronco mesenquimais humanas isoladas de gordura. Para indução de autofagia foi utilizado o tratamento com Rapamicina 200 nM, o indutor clássico de autofagia, por 24 h para culturas murinas e 48 h para cultura humana.

Pela análise da marcação com AO foi possível observar o aumento do desenvolvimento de AVOs em todas as culturas primárias, conforme apresentado na Figura 14, reforçando a utilidade da marcação com AO para detecção da indução de autofagia mesmo em culturas primárias.

Figura 14 – Avaliação da indução de autofagia em culturas de células primárias pela marcação com AO. (A) Plotagens representativas da detecção por citometria de fluxo das fluorescências verde e vermelha em células marcadas com AO, indicando a quantificação da formação de AVOs. (B) Gráfico de barras mostrando a média ± DP do aumento da proporção de células positivas em relação ao controle para três experimentos independentes. rSF – Fibloblastos murinos derivados da pele; rLF – Fibroblastos murinos derivados do pulmão; hADSC – Células tronco mesenquimais humanas derivadas de gordura.

ii. Fluorescence activated cell sorting – FACS – de populações marcadas com

AO

Essa abordagem tem o objetivo de mostrar diferenças nos níveis de autofagia comparando as populações de maior e menor atividade autofágica na detecção da marcação com AO, que serão aqui chamadas populações ‘high autophagy/P+’ e ‘low

autophagy/P-’. Para isso, foram utilizadas células U87 tratadas com rapamicina nas

mesmas condições apresentadas no capítulo do artigo científico. As células marcadas com AO tiveram suas fluorescências verde e vermelha detectadas em um citômetro BD FACSAria III e a quantificação da marcação foi feita utilizando o software BD FACSDiva.

O tratamento com rapamicina provocou um aumento da população positiva em 6,3 vezes em relação ao controle (Controle - 12,9 %; Rapamicina 81,6 %) (Fig. 15A), consistente com os resultados previamente obtidos e apresentados na Figura 2C do artigo. Para as células tratadas foram delimitados dois gates: ‘P+’ (que representa as células com maior atividade autofágica) e ‘P-‘ (com menor atividade autofágica) (Fig. 15A – direita). Essas duas populações foram separadas por FACS e coletadas em solução de lise desnaturante para avaliação por western blot do perfil de proteínas envolvidas no processo autofágico. Ao final da separação, uma fração das populações P+ e P- foram coletadas para avaliar a pureza e eficiência da separação (Fig. 15B), ficando clara a diferença entre elas. Observou-se um leve deslocamento para a esquerda e para baixo no gráfico para ambas as populações, indicando a perda de fluorescência, que possivelmente se justifica por essas células já terem sido previamente excitadas pelo laser, provocando redução da fluorescência do marcador, ou pelo fato de estar sendo avaliado um processo dinâmico em células vivas e essas terem alterado seu estado autofágico ao longo da separação.

Adaptamos a recomendação do revisor e realizaremos avaliação por western

blot das proteínas LC3-I/II e SQSTM1/p62, comparando as diferentes populações

provenientes de FACS. Um resultado preliminar mostra a diferença do nível da proteína LC3-II entre o controle e a população P+ mostrando, conforme esperado, um acúmulo nessa última (Fig. 15C). Pretendemos mostrar diferenças LC3-I/II e para p62 entre as populaçõs P+ e P-, para assim confirmar plenamente as vantagens desta abordagem para quantificar os dados provenientes da marcação com AO.

Figura 15 – FACS de células marcadas com AO. (A) Quantificação da indução de autofagia por rapamicina em células U87 – limiar vermelho – e delimitação dos gates para separação por FACS das populações P- e P+, que representam as populações com maior e menor atividade autofágica, respectivamente; (B) Análise pós FACS das populações P- e P+; (C) Detecção por western blot da proteína LC3-I/II das populações controle, P- e P+.

8 Discussão

O estudo de autofagia tem sido de grande interesse nos últimos anos dado o reconhecimento deste mecanismo celular estar envolvido em processos fisiológicos e patológicos. Consequentemente, existe uma necessidade crescente do aperfeiçoamento e desenvolvimento de novas ferramentas para detectar com precisão a autofagia em sistemas biológicos, especialmente em células de mamíferos. Isso favorecerá uma melhor compreensão do envolvimento da autofagia nos processos biológicos, permitindo sua manipulação para fins terapêuticos.

Foi demonstrado na década de 1960 por Elliott Robbins e colaboradores que AO acumula e emite fluorescência em vesículas intracelulares, inicialmente chamadas ‘partículas de laranja de acridina’, e posteriormente mostradas que representavam corpos multivesiculares (Robbins e Marcus, 1963; Robbins et al., 1964).Com o avanço nos estudos de autofagia mostrou-se que corpos multivesiculares se fundem com autofagossomos e em seguida ocorre a degradação do material interno dessa organela pela via lisossomal (Fader e Colombo, 2009). Isso torna AO uma sonda atrativa para a avaliação da etapa final da autofagia e aperfeiçoamentos na técnica favorecerão sua maior utilização.

O presente trabalho teve como principal objetivo demonstrar que o marcador AO é uma sonda que pode ser utilizada para medir autofagia, desde que sejam consideradas as possíveis alterações celulares que influenciam em sua incorporação e marcação. Para essa correção, sugerimos a análise da relação entre fluorescências verde e vermelha, a qual denominamos ‘análise relativa de AO’, ao contrário da análise usual, que é feita levando em conta somente a fluorescência vermelha.

Validamos que a análise relativa de AO é capaz de detectar a indução de autofagia em linhagens celulares e em culturas primárias. Além disso, com esta análise mostramos o bloqueio genético e farmacológico da autofagia, a qual teve resultados de acordo com os métodos mais comumente utilizados para detectar autofagia. Também mostramos que a análise relativa de AO gera resultados que correlacionam melhor com esses outros métodos, quando comparada com a análise usual da fluorescência vermelha absoluta, pois é capaz de corrigir resultados falso positivos ou

falso negativos desse último tipo de análise, tornando essa abordagem útil para avaliação da modulação de autofagia por tratamentos que provocam alteração do tamanho celular.

Por ser um método quantitativo e dada a sua facilidade de utilização, esperamos que o marcador AO tenha uma melhor aceitação e maior utilização como um método de triagem no estudo de autofagia, sempre acompanhado por outros ensaios específicos para corroborar os resultados.

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