4.1. Análise Comportamental
4.1.1. Análise Comportamental BBB e CBS
Os efeitos da lesão medular isquêmica sobre os índices BBB e CBS foram avaliados segundo o teste ANOVA de duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. A análise estatística mostrou efeitos do tempo e do tratamento com PEDF quando os três grupos foram analisados, bem como quando apenas os grupos Salina e PEDF foram incluídos na avaliação. Entretanto, diferenças na interação tempo/tratamento apareceram apenas quando os três grupos foram tratados conjuntamente (tabela 4). Ainda, diferenças entre o grupo Sham e os grupos Salina e PEDF foram apontadas em todos os períodos avaliados (p<0,05), porém nenhuma diferença foi observada entre os grupos Salina e PEDF nestes períodos (figura 5).
Nos testes que compõem o índice CBS, a análise estatística ANOVA de duas vias realizada nos três grupos experimentais mostrou efeito do tratamento no teste de dor, efeitos do tempo e do tratamento nos testes de extensão e pressão, e, efeitos do tempo, do tratamento e da interação entre eles nos testes Tarlov, extensão dos dedos, reflexo de colocação, reflexo de endireitamento e plano inclinado. O tratamento estatístico realizado nos grupos Salina e PEDF mostrou um efeito temporal nos testes Tarlov, pressão e reflexo de colocação, efeito do tratamento com PEDF no teste reflexo de endireitamento, efeitos do tempo e do tratamento nos testes de extensão e extensão dos dedos, e por fim,
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efeitos do tempo, do tratamento e da interação entre eles no plano inclinado (tabela 5). De acordo com o pós-teste de Bonferroni, diferenças entre o grupo Sham e os grupos lesados foram observadas em todos os testes avaliados, com exceção de alguns períodos: entre a 1°-3° e a 4°-6° semana de avaliação no teste de pressão, nenhuma diferença entre os grupos Sham e Salina foi observada, e no que diz respeito à análise comparativa entre os grupos Sham e PEDF, nenhuma diferença foi observada entre a 4°-6° semana no teste de extensão, entre o 1°-3° dia e entre a 4°-6° semana no teste de dor, entre a 1°-3° e a 4°-6° semana no teste de pressão, entre a 4°-6° semana no teste extensão dos dedos e entre a 1°-3° e a 4°-6° semana no teste plano inclinado. Por fim, diferenças entre os grupos Salina e PEDF foram apontadas nos testes de extensão dos dedos e plano inclinado entre a 4°-6° semana de avaliação (figura 6).
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Tabela 4: Dados referentes às análises comportamentais BBB e CBS obtidos através da análise estatística ANOVA de duas vias.
Comparações entre os três grupos
Teste Tempo Tratamento Interação
BBB p<0,0001; F=64,66 p<0,0001; F=285,5 p<0,0001; F=4,6 CBS p<0,0001; F=62,37 p<0,0001; F=245,9 p<0,0001; F=5,85
Salina X PEDF
Teste Tempo Tratamento Interação
BBB p<0,0001; F=76,19 p=0,02; F=5,234 p>0,5; F=0,144 CBS p<0,0001; F=68,27 p=0,0003; F=13,21 p>0,5; F=0,257
Figura 5: Os gráficos mostram as médias e os e.p.m. dos índices BBB (A) e CBS (B) e comparam ao longo do tempo a evolução do comportamento sensório-motor dos grupos experimentais Sham, Salina e PEDF. As análises foram realizadas diariamente até o 3° dia e depois semanalmente até o final do período de 6 semanas. A análise segundo o teste ANOVA de duas vias mostra que a melhora no padrão de recuperação sensório-motora nos animais com lesão medular isquêmica depende do tempo após a lesão (p<0,0001) e do tratamento com PEDF (p<0,05) para o BBB e CBS. O pós-teste de Bonferroni apontou diferenças entre o grupo Sham e os grupos Salina e PEDF em todos os períodos avaliados (p<0,05) e nenhuma diferença foi vista entre os grupos Salina e PEDF.
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Tabela 5: Dados referentes aos testes que compõem o índice CBS obtidos através da análise estatística ANOVA de duas vias.
Comparações entre os três grupos
Parâmetros Tempo Tratamento Interação
Tarlov p<0,0001; F=87,19 p<0,0001; F=65,92 p<0,0001; F=9,764
Extensão p=0,005; F=5,538 p<0,0001; F=22,40 p>0,05; F=0,507
Dor p>0,9; F=0,1032 p<0,0001; F=13,87 p>0,05; F=0,0633
Pressão p=0,0018; F=6,617 p<0,0001; F=13,50 p>0,5; F=0,2423
Extensão dos dedos p<0,0001; F=64,63 p<0,0001; F=70,83 p<0,0001; F=10,67 Reflexo de colocação p<0,0001; F=91,14 p<0,0001; F=119,3 p<0,0001; F=8,453 Reflexo de endireitamento p<0,0001; F=10,88 p<0,0001; F=90,95 p<0,0001; F=9,488 Plano inclinado p<0,0001; F=101,4 p<0,0001; F=32,99 p<0,0001; F=7,516
Salina X PEDF
Parâmetros Tempo Tratamento Interação
Tarlov p<0,0001; F=119,3 p>0,05; F=1,144 p>0,05; F=0,1416
Extensão p=0,01; F=4,106 p=0,04; F=4,276 p>0,05; F=0,1378
Dor p>0,05; F=0,1385 p>0,05; F=1,865 p>0,05; F=0,0198
Pressão p=0,005; F=5,438 p>0,05; F=1,025 p>0,05; F=0,0157
Extensão dos dedos p<0,0001; F=81,84 p=0,001; F=11,38 p>0,05; F=0,7145 Reflexo de colocação p<0,0001; F=111,7 p>0,05; F=2,408 p>0,05; F=0,3490 Reflexo de endireitamento p>0,05; F=0,3132 p=0,04; F=4,244 p>0,05; F=0,7441 Plano inclinado p<0,0001; F=99,14 p=0,002; F=9,543 p=0,004; F=5,80
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Figura 6: Os gráficos mostram as médias e os e.p.m. das avaliações que compõem o índice CBS e compara ao longo do tempo a evolução dos parâmetros sensório-motores dos grupos Sham, Salina e PEDF. Os seguintes testes foram realizados: Escala locomotora de Tarlov (A), reflexos de retirada em resposta a estímulos de extensão (B), dor (C) e pressão (D), reflexo de extensão dos dedos (E), reflexo de colocação (F), reflexo de endireitamento (G) e plano inclinado (H). Os testes foram realizados diariamente até o 3° dia e depois realizados semanalmente até o final do período de 6 semanas e agrupados em três períodos, como ilustrado acima. A análise segundo o teste ANOVA de duas vias mostra que a recuperação sensório-motora nos animais com lesão medular isquêmica depende em A, D e F do tempo após a lesão, em G do tratamento com PEDF, em B e E do tempo e do tratamento e H depende do tempo, do tratamento e da interação entre eles. De acordo com o pós-teste de Bonferroni, é ilustrado # (p<0,05) quando o grupo Salina e/ou PEDF difere do Sham e * (p<0,05) ou ** (p<0,001) quando o grupo PEDF difere do Salina.
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4.1.2. Análise Motora Fina – Impressão de Pegadas
Os resultados da análise motora fina mostraram efeitos do tempo e do tratamento em todas as avaliações que compõem o teste impressão de pegadas, quando os três grupos foram comparados. Ainda, observou-se um efeito temporal nas avaliações comprimento da passada, distância entre o calcanhar e o 3° dedo e distância entre o 2° e o 4° dedo, quando apenas os grupos Salina e PEDF foram analisados, segundo o teste ANOVA de duas vias (tabela 6). O pós-teste de Bonferroni mostrou diferenças entre o grupo Sham e os grupos lesionados, entretanto, nenhuma diferença foi observada entre os grupos Salina e PEDF (figura 7).
Tabela 6: Dados referentes às avaliações que compõem o teste impressão de pegadas obtidos através da análise estatística ANOVA de duas vias.
Comparações entre os três grupos
Descrição Tempo Tratamento Interação
Comprimento da passada p=0,002; F=3,803 p<0,0001; F=22,60 p>0,05; F=1,087 Distância entre o calcanhar e o
3° dedo p=0,0001; F=5,261 p<0,0001; F=26,46 p>0,05 F=0,651
Distância entre o 1° e o 5° dedo p=0,0003; F=4,954 p<0,0001; F=43,98 p>0,05; F=0,657 Distância entre o 2° e o 4° dedo p=0,0009; F=4,317 p<0,0001; F=19,79 p>0,05; F=0,192
Salina X PEDF
Descrição Tempo Tratamento Interação
Comprimento da passada p=0,001; F=4,018 p>0,05; F=0,458 p>0,05; F=0,874 Distância entre o calcanhar e o
3° dedo p=0,0004; F=4,789 p>0,05; F=8,45 p>0,05; F=0,345
Distância entre o 1° e o 5° dedo p>0,05; F=1,759 p>0,05; F=0,230 p>0,05; F=0,470 Distância entre o 2° e o 4° dedo p=0,02; F=2,562 p>0,05; F=0,003 p>0,05; F=0,234
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Figura 7: Os gráficos mostram as médias e os e.p.m. da análise motora fina, realizado através do teste impressão de pegadas e compara ao longo do tempo a evolução dos parâmetros motores dos grupos Sham, Salina e PEDF. Os seguintes testes foram realizados: Comprimento da passada (A), distância entre o calcanhar e o 3º dedo (B), distância entre o 1º e o 5 º dedo (C) e distância entre o 2º e o 4º dedo (D). Os testes foram realizados semanalmente até o final do período de 6 semanas, como ilustrado acima. A análise segundo o teste de variância ANOVA de duas vias mostra que a melhora no padrão de recuperação motora nos animais com lesão medular isquêmica depende, em A, B e D, do tempo após a lesão. De acordo com o pós-teste de Bonferroni, é ilustrado # (p<0,05) quando o grupo Sham difere do Salina e * (p<0,05) quando o Sham difere do grupo PEDF.
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4.2. Análise de Moléculas Inibidoras do Crescimento de Fibras
A análise protéica das CSPGs, quantificadas nos homogenados colhidos na porção lombar anterior da medula espinal, por meio de western blot, mostrou duas bandas com pesos moleculares distintos. Na banda de 150 kDa, nenhuma diferença significante foi observada entre os grupos experimentais, entretanto, os dados apontam uma diminuição no nível das CSPGs na banda de 70 kDa, nos grupos Salina e PEDF em relação ao grupo Sham (figura 8).
Figura 8: A figura mostra a densidade óptica relativa dos níveis de proteína das Proteoglicanas de Sulfato de Condroitina (CSPGs) de peso molecular de 150kDa (A) e 70kDa (B), na região lombar anterior da medula espinal. α-Tubulina (50kDa) foi utilizada como controle. Observam-se os grupos Sham, Salina e PEDF. A análise realizada segundo o teste de variância ANOVA de uma via, seguido do pós-teste de Tukey, mostrou uma diminuição no nível das CSPGs na banda de 70 kDa dos grupos Salina e PEDF em relação ao Sham (*p<0,05).
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4.3. Análise dos Fatores Neurotróficos
O estudo da expressão relativa de RNAm dos fatores neurotróficos NT-3, GDNF, BDNF e FGF-2 foi realizado na porção lombar anterior da medula espinal, pelo método da RT-PCR. O resultado mostrou uma diminuição na expressão do NT-3 no grupo PEDF em relação ao Sham. Em contra partida, foi observado um aumento na expressão do GDNF no grupo PEDF em relação aos grupos Sham e Salina e nenhuma diferença foi observada entre os grupos ao analisar os fatores neurotróficos BDNF e FGF-2 (figura 9).
Figura 9: A figura mostra a expressão relativa de RNAm dos fatores neurotróficos NT-3 (A), FGF- 2 (B), BDNF (C) e GDNF (D), na região lombar anterior da medula espinal. Observam-se os grupos Sham, Salina e PEDF. A análise segundo o teste de variância ANOVA de uma via, seguido do pós-teste de Tukey, mostra uma diminuição da expressão gênica do NT-3 no grupo PEDF em relação ao Sham (*p<0,05) e um aumento da expressão gênica do GDNF no grupo PEDF em relação aos grupos Sham e Salina (*p<0,05; **p<0,01).
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Em relação à quantificação protéica do PEDF realizada na mesma região, todavia pela técnica de western blot, nenhuma diferença foi observada entre os grupos experimentais no período do pós-operatório escolhido neste estudo (figura 10).
Figura 10: A figura mostra a densidade óptica relativa do nível de proteína do PEDF (90kDa) na região lombar anterior da medula espinal. α-Tubulina (50kDa) foi utilizada como controle. Observam-se os grupos Sham, Salina e PEDF. A análise foi realizada segundo o teste de variância ANOVA de uma via, seguido do pós-teste de Tukey.
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4.4. Análise da Angiogênese e Apoptose Local
De acordo com a quantificação protéica da laminina e do Bcl- 2 efetuada na região lombar anterior da medula espinal, por meio do Western Blot, os resultados mostraram um aumento no nível da laminina no grupo Salina quando comparado com o Sham e uma diminuição do grupo PEDF em relação ao Salina. Em relação ao Bcl-2, nenhuma alteração foi demonstrada entre os grupos no período do pós- operatório estudado (figura 11).
Figura 11: A figura mostra a densidade óptica relativa dos níveis de proteína da laminina (A), de 205kDa, e do Bcl-2 (B), de 26kDa, na região lombar anterior da medula espinal. α-Tubulina (50kDa) foi utilizada como controle. Observam-se os grupos Sham, Salina e PEDF. A análise realizada segundo o teste de variância ANOVA de uma via, seguido do pós-teste de Tukey, mostrou um aumento no nível da laminina no grupo Salina quando comparado com os outros grupos (*p<0,05 e **p<0,01).
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4.5. Análise de Moléculas Relacionadas à Neuroplasticidade
A análise da imunorreatividade da MAP-2 foi realizada através da imunoperoxidase, a qual mostrou um aumento significativo de sua expressão no corno anterior da região lombar da medula espinal lesada e tratada com PEDF, quando comparada com os grupos Sham e Salina (figuras 12 e 13). Contudo, a análise da imunorreatividade da GAP-43 não mostrou alterações significativas quando os grupos foram comparados (figura 12).
Figura 12: Os gráficos mostram as médias e os e.p.m. das áreas da imunorreatividade da MAP-2 (A) e da GAP-43 (B), no corno anterior da medula espinal em um segmento da intumescência lombar, caudal à lesão, obtidas por análise morfométrica e microdensitométrica dos animais Sham, Salina e PEDF. A análise realizada segundo o teste de variância ANOVA de uma via, seguido do pós teste de Tukey, mostrou alterações na área da imunorreatividade da MAP-2 quando comparados os grupos Sham e Salina com o grupo PEDF (***p<0,001).
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Figura 13: Fotomicrografias ilustrando o padrão de marcação da imunorreatividade à MAP-2 no corno anterior da medula espinal em um segmento da intumescência lombar de ratos que sofreram a cirurgia simulada (A, B) ou lesão isquêmica fototrombótica e tratados com PEDF (C, D) após 6 semanas da cirurgia. As setas indicam neurônios e pode-se observar a arborização dendrítica. Barra = 100μm (A,C) e 30μm B,D.
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Ao quantificar as proteínas estruturais MAP-2, GAP-43 e sinaptofisina na região lombar anterior da medula espinal, por meio do western blot, os dados confirmaram o aumento no nível da MAP-2 nos animais tratados com PEDF em relação ao Sham e nenhuma alteração significativa foi demonstrada no nível da GAP-43 e da sinaptofisina no período de pós-operatório definido neste estudo (figura 14).
Figura 14: A figura mostra a densidade óptica relativa dos níveis de proteína dos marcadores estruturais MAP-2 (A), de 70 kDa, GAP-43 (B), de 43kDa, e Sinaptofisina (C), de 43kDa, na região lombar anterior da medula espinal. α-Tubulina (50kDa) foi utilizada como controle. Observam-se os grupos Sham, Salina e PEDF. A análise realizada segundo o teste de variância ANOVA de uma via, seguido do pós-teste de Tukey, mostrou um aumento no nível da MAP-2 no grupo PEDF quando comparado com o grupo Sham (* p<0,05).
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4.6. Análise de Moléculas do Sistema Eph/Efrina
Os níveis protéicos dos subtipos A e B dos receptores Eph, bem como das efrinas, foram quantificados por meio de western blot na porção lombar anterior da medula espinal.
Os resultados evidenciaram um aumento no nível do receptor EphA4 nos grupos Salina e PEDF quando comparados com o Sham, sem alteração nos níveis protéicos dos receptores EphA2, A3, A5 e A7 (figura 15). Nos receptores do tipo B, nenhuma diferença foi observada entre os grupos, como mostra a figura 16. Em relação às efrinas do tipo A, observou-se um aumento no nível da efrina-A2 no grupo PEDF em relação ao Sham, sem alteração nos níveis das efrinas A1, A3, A4 e A5 com os tratamentos aplicados (figura 17). Diferenças também foram encontradas nas efrinas do tipo B, onde um aumento na expressão da efrina-B1 foi observado nos grupos Salina e PEDF em relação ao Sham, um aumento no nível da efrina-B2 foi vista no grupo PEDF em relação aos grupos Sham e Salina, bem como houve um aumento no nível da efrina-B3 no grupo PEDF em relação ao Sham (figura 18).
Alguns subtipos de receptores Eph estudados, particularmente os EphA1, A6, A8, A10, B2 e B3, tiveram marcações inespecíficas ou ausentes quando analisados através do western blot, mesmo após testes utilizando protocolos com diferentes concentrações de proteína e anticorpo.
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Figura 15: A figura mostra a densidade óptica relativa dos níveis de proteína dos receptores EphA2 (A), de 130kDa, EphA3 (B), de 110kDa, EphA4 (C), de 120kDa, EphA5 (D), de 35kDa, e EphA7 (E), de 90kDa, na região lombar anterior da medula espinal. α-Tubulina (50kDa) foi utilizada como controle. Observam-se os grupos Sham, Salina e PEDF. A análise realizada segundo o teste de variância ANOVA de uma via, seguido do pós-teste de Tukey, mostra um aumento no nível do receptor EphA4 (* p<0,05) nos grupos Salina e PEDF em relação ao Sham.
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Figura 16: A figura mostra a densidade óptica relativa dos níveis de proteína dos receptores EphB1 (A), de 130kDa, EphB4 (B), de 120kDa, e EphB6 (C), de 109kDa, na região lombar anterior da medula espinal. α-Tubulina (50kDa) foi utilizada como controle. Observam-se os grupos Sham, Salina e PEDF. A análise foi realizada segundo o teste de variância ANOVA de uma via, seguido do pós-teste de Tukey.
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Figura 17: A figura mostra a densidade óptica relativa dos níveis de proteína das efrinas-A1 (A), de 24kDa, A2 (B), de 46kDa, A3 (C), de 40kDa, A4 (D), de 35kDa, e A5 (E), de 45kDa, na região lombar anterior da medula espinal. α-Tubulina (50kDa) foi utilizada como controle. Observam-se os grupos Sham, Salina e PEDF. A análise realizada segundo o teste de variância ANOVA de uma via, seguido do pós-teste de Tukey, mostra um aumento no nível da proteína efrina-A2 no grupo PEDF em relação ao grupo Sham (* p<0,05).
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Figura 18: A figura mostra a densidade óptica relativa dos níveis de proteína das efrinas-B1 (A), de 45kDa, B2 (B), de 37kDa, e B3 (C), de 43kDa, na região lombar anterior da medula espinal. α- Tubulina (50kDa) foi utilizada como controle. Observam-se os grupos Sham, Salina e PEDF. A análise realizada segundo o teste de variância ANOVA de uma via, seguido do pós-teste de Tukey, mostra um aumento no nível da proteína efrina-B1 nos grupos Salina e PEDF em relação ao Sham, um aumento no nível da efrina-B2 no grupo PEDF em relação aos grupos Sham e Salina e um aumento no nível da efrina-B3 no grupo PEDF em relação ao Sham (* p<0,05).
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Ainda, a análise da expressão relativa de RNAm dos receptores EphA6 e EphB2, realizada pela técnica de RT-PCR na mesma região, não demonstrou nenhuma diferença na expressão gênica entre os grupos (figura 19). De forma similar, não foi observado nenhuma diferença entre os grupos experimentais na análise da expressão de RNAm da RhoA (figura 20).
Figura 19: A figura mostra a expressão relativa de RNAm dos receptores EphA6 (A) e EphB2 (B) na porção ventral da medula espinal caudal à lesão. Observam-se os grupos Sham, Salina e PEDF. A análise foi realizada segundo o teste de variância ANOVA de uma via, seguido do pós- teste de Tukey.
Figura 20: A figura mostra a expressão relativa de RNAm da RhoA na porção ventral da medula espinal caudal à lesão. Observam-se os grupos Sham, Salina e PEDF. A análise foi realizada segundo o teste de variância ANOVA de uma via, seguido do pós-teste de Tukey.
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4.7. Análise da Localização Celular dos Receptores Eph/Efrinas
A localização celular dos subtipos dos receptores Eph e das efrinas foi avaliada através da técnica de imunofluorescência de duas cores. Para isso, as imunorreatividades de receptores e efrinas foram marcadas simultaneamente com as imunorreatividades do GFAP (marcador astrocitário) ou NF-200 (marcador neuronal). No corno anterior da região lombar da medula espinal, receptores do tipo A, EphA2 e EphA7 (figura 21), do tipo B, EphB1, EphB4 e EphB6 (figura 22), bem como a efrina-A5 (figura 23), foram colocalizados com o NF-200, portanto em neurônios. As efrinas B1, B2 e B3 foram por sua vez colocalizadas com a imunorreatividade do GFAP, portanto em astrócitos da região avaliada (figura 24).
Receptores Eph e efrinas que não tiveram marcações específicas (sinal de marcação muito fraca ou ausente) no corno anterior foram analisados em outras áreas da mesma secção. A imunorreatividade do receptor EphA4, colocalizado com o NF-200, foi observada na raiz ventral do nervo (figura 25). No funículo posterior da região lombar, foram avaliados os receptores EphA3 e EphA5 (figura 26), duplamente marcados com NF-200, e as efrinas A1, A2, A3 e A4, duplamente marcadas com GFAP (figura 27).
Subtipos de receptores que não puderam ser avaliados pela técnica de western blot, pois o sinal era muito fraco ou inesistente, foram marcados pela imunofluorecência no segmento onde foi realizada a lesão. A imunorreatividade dos receptores EphA1 e EphA8, duplamente marcados com NF-200, foi observada no corno anterior da medula espinal (figura 28), onde o tecido medular encontrava-se preservado. Na área da lesão propriamente dita (funículo
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posterior), os receptores do tipo A, EphA6 e EphA10 (figura 29), e do tipo B, EphB2 e EphB3 (figura 30), foram duplamente marcados com GFAP.
Figura 21: Fotomicrografias mostrando a localização celular dos receptores do tipo A estudados no corno anterior da medula espinal na região lombar do grupo PEDF. (A-C) Imunofluorescência de duas cores do receptor EphA2 (verde) com NF-200 (vermelho) e a colocalização das duas marcações. (D-F) Imunofluorescência de duas cores do receptor EphA7 (verde) com NF-200 (vermelho) e a colocalização das duas marcações. As setas indicam as colocalizações. Barras de escala=30µm.
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Figura 22: Fotomicrografias mostrando a localização celular dos receptores do tipo B estudados no corno anterior da medula espinal na região lombar do grupo PEDF. (A-C) Imunofluorescência de duas cores do receptor EphB1 (verde) com NF-200 (vermelho) e a colocalização das duas marcações. (D-F) Imunofluorescência de duas cores do receptor EphB4 (verde) com NF-200 (vermelho) e a colocalização das duas marcações. (G-I) Imunofluorescência de duas cores do receptor B6 (verde) com NF-200 (vermelho) e a colocalização das duas marcações. As setas indicam as colocalizações. Barras de escala=30µm.
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Figura 23: Fotomicrografias mostrando a localização celular da efrina-A5 estudada no corno anterior da medula espinal na região lombar do grupo PEDF. (A-C) Imunofluorescência de duas cores da efrina-A5 (verde) com NF-200 (vermelho) e a colocalização das duas marcações. As setas indicam as colocalizações. Barras de escala=30µm.
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Figura 24: Fotomicrografias mostrando a localização celular das efrinas B estudadas no corno anterior da medula espinal na região lombar do grupo PEDF. (A-C) Imunofluorescência de duas cores da efrina-B1 (vermelho) com GFAP (verde) e a colocalização das duas marcações. (D-F) Imunofluorescência de duas cores da efrina-B2 (verde) com GFAP (vermelho) e a colocalização das duas marcações. (G-I) Imunofluorescência de duas cores da efrina-B3 (vermelho) com GFAP (verde) e a colocalização das duas marcações. As setas indicam as colocalizações. Barras de escala=30µm.
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Figura 25: Fotomicrografias mostrando a localização celular do receptor EphA4 estudado na raiz ventral do nervo da medula espinal do grupo PEDF. (A-C) Imunofluorescência de duas cores do receptor EphA4 (vermelho) com NF-200 (verde) e a não colocalização das duas marcações. As setas indicam as marcações com o receptor EphA4 e as pontas de setas as marcações com NF- 200. Barras de escala=20µm.
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Figura 26: Fotomicrografias mostrando a localização celular dos receptores do tipo A estudados no funículo posterior da medula espinal na região lombar do grupo PEDF. (A-C) Imunofluorescência de duas cores do receptor EphA3 (verde) com NF-200 (vermelho) e a colocalização das duas marcações em algumas áreas. (D-F) Imunofluorescência de duas cores do