5.1. Isolamento de subclones a partir de PDLSC
A partir de uma população de cultura primária de PDLSC, 48 colônias originadas a partir de uma única célula (subclones) foram isoladas e plaqueadas em um poço de uma placa de 24 poços. Contudo, destes 48 subclones, apenas 16 apresentaram capacidade de alcançar confluência nas sucessivas placas de cultivo até alcançarem quantidade suficiente para serem congeladas para experimentos futuros. Entretanto, após o descongelamento dos subclones para a realização dos experimentos, somente seis subclones mantiveram a viabilidade e potencial proliferativo que permitiram obter quantidade suficiente de células para a realização do presente estudo (Figura 2).
Isolamento de subclones (cilindro de clonagem) 1 subclone / poço (2 placas de 24 poços)
48 subclones
Passagem para placa de 60 mm 32 subclones
16 subclones não entraram em
confluência
Passagem para garrafa 75 cm2 27 subclones 5 subclones não entraram em confluência Congelamento 16 subclones 11 subclones não entraram em confluência 10 subclones não proliferaram após descongelamento Descongelamento e expansão de PDLSC (CD105+, CD34-, CD45-) Plaqueamento de 250 células de PDLSC /placa de 100 mm (5 placas)
5.2. Seleção dos subclones com potencial de diferenciação osteoblástica/cementoblástica por meio de ensaio de mineralização
Pelo ensaio de Von Kossa, observou-se que três subclones (C 1, 13 e 42) apresentaram sua capacidade de formar nódulos minerais in vitro, sendo então categorizados como subclones comprometidos com o fenótipo osteoblástico/cementoblástico (C-O), e outros três (C 32, 33 e 47) não apresentaram tal capacidade, sendo categorizados como comprometidos com perfil fibroblástico (C-F) (Figura 3).
Figura 3. Aspecto macroscópico do ensaio de Von Kossa realizado para os seis subclones isolados de pool de PDLSC após 28 dias de cultivo em meio de cultura padrão (Controle) ou meio de indução osteogênico (Meio Osteogênico), demonstrando que os subclones C 1, 13 e 42 apresentaram capacidade de mineralização in vitro quando cultivados sob indução osteogênica, enquanto outros subclones C 32, 33, 47 não apresentaram tal capacidade.
5.3. Caracterização dos subclones com fenótipo osteoblástico/cementoblástico (C- O) e fenótipo fibroblástico (C-F)
5.3.1. Viabilidade e capacidade proliferativa – Ensaio de MTS
Os subclones com perfil fibroblástico (C-F) apresentaram maior capacidade de proliferação ao longo do período avaliado, sendo que houve um aumento significativo na quantidade de células viáveis nos períodos de 7 e 10 dias em comparação com os períodos iniciais (1 e 3 dias) (p≤0,05). Já os subclones com perfil osteoblástico/cementoblástico apresentaram menor potencial proliferativo (C-O), sendo que houve um aumento significativo no número de células viáveis comparando-se o sétimo dia de cultivo em relação ao primeiro dia (p≤0.05), mas que não se manteve ao final do período avaliado, no
décimo dia de cultivo (p> 0,05) (Figura 4). Além disso, observou-se que no sétimo e no décimo dia de cultivo, a quantidade de células viáveis no grupo dos subclones com perfil fibroblástico (C-F) apresentou-se significativamente maior do que no grupo com perfil osteoblástico/cementoblástico (C-O) (p≤0,05) (Figura 4).
Figura 4. Viabilidade e capacidade proliferativa dos subclones com perfil fibroblástico (C- F) e perfil osteoblástico/cementoblástico (C-O) ao longo de 10 dias de cultivo avaliadas por meio de ensaio de MTS. Quadrado ou losângulo em cada período representam média + desvio padrão. Letras maiúsculas distintas representam diferença significativa intergrupo (C-F vs C-O) e letras minúsculas distintas representam diferença significativa intragrupo (entre os dias) (p≤0,05) (Teste de Tukey Kramer).
5.3.2. Imunofluorescência para STRO-1
Todos os subclones, tanto do grupo C-O quanto do grupo C-F, expressaram o marcador relacionado a células mesenquimais indiferenciadas STRO-1 (Figura 5).
Figura 5. Imunomarcação para STRO-1 mostrou que tanto os subclones C-O (C 1, C 13 e C 42) quanto os sublcones C-F (C 32, C 33 e C 47) expressaram o marcador STRO-1.
5.3.3. Expressão gênica dos marcadores biológicos relacionados ao fenótipo osteoblástico/cementoblástico (RUNX2 e ALP) e relacionados ao fenótipo mesenquimal indiferenciado (CD105, CD166 e OCT-4)
A avaliação da expressão dos genes RUNX2 e ALP demonstrou que todos os subclones do grupo C-O apresentaram aumento na expressão destes genes quando cultivados em meio de indução osteogênica (OM), indicando o comprometimento dos mesmos com o fenótipo osteoblástico/cementoblástico. Em relação ao gene RUNX2, em ambas as condições de cultura (sob indução osteogênica ou não) foi observado um aumento na sua expressão a partir do dia 3, o qual se manteve até o dia 14. Esse aumento nos níveis de RNA mensageiro (RNAm) foi significativo quando os subclones foram cultivados sob indução osteogênica (OM) (p<0.0001) comparado quando cultivados em meio de cultura padrão (DMEM) (Figura 6A). Quanto à expressão do gene ALP, embora seja possível observar pela Figura 6B que o aumento na expressão desse gene ocorreu somente nos subclones celulares cultivados em meio osteogênico, não foram detectadas diferenças estatisticamente significantes entre os dois grupos (OM e DMEM) em nenhum período experimental. Isto se deve ao fato dos subclones terem apresentado uma grande
C 1 (C-O) C 13 (C-O) C 42 (C-O)
variabilidade no padrão de expressão do gene ALP quando submetidos à indução osteogênica. Como observado na Figura 7B, aos 3 dias em cultura, todos os subclones do grupo OM apresentam uma expressão aumentada do gene ALP. Contudo, aos 7 e 14 dias em cultura, somente o subclone C42 manteve esse perfil de expressão, enquanto que o C13 apresentou um pico de expressão aos 14 dias (Figura 7B). Essa variabilidade entre os subclones C-O durante o processo de maturação em fenótipo osteoblástico/cementoblástico, também foi observada para a expressão do gene RUNX2 (Figura 7A), porém, com menor oscilação entre os subclones nos diferentes períodos de observação.
Figura 6. Análise de expressão de genes relacionados ao fenótipo osteoblástico/cementoblástico por real time PCR. Aumento na expressão dos genes RUNX2 (A) e ALP (B) apresentado pelos subclones do grupo C-O cultivados em meio osteogênico (OM) durante os três períodos experimentais. Quadrado ou losângulo e barras em cada período representam média+desvio-padrão. Diferença significativa intergrupo está assinalada por * (p≤0,05) (Teste de Tukey Kramer).
Figura 7. Variabilidade no padrão de expressão dos genes RUNX2 (A) e ALP (B) dos subclones do grupo C-O cultivados sob indução osteogênica (OM) ou não (DMEM) e analisados pela técnica do real time PCR.
A B
sob indução osteogênica (OM), diferenças estatisticamente significativas não foram observadas quando comparados com o cultivo sem indução (DMEM). Isto ocorreu devido à grande variabilidade no padrão de expressão desses genes pelos três subclones do grupo C-O. Conforme demonstrado pelas Figuras 9A e 9B, somente o clone C13 apresentou um aumento expressivo dos genes CD105 e OCT-4 sob indução osteogênica nos períodos de 7 e 14 dias. Um aumento significativo (p=0,027) nos níveis de RNAm para CD166 foi observado em todos os períodos experimentais, quando os subclones C-O foram cultivados sob indução osteogênica (Figura 8C). A variabilidade no padrão de expressão entre os subclones do grupo C-O também foi observada para o gene CD166 (Figura 9C), porém, com menor oscilação entre os subclones nos diferentes períodos de observação.
Figura 8. Análise por real time PCR da expressão dos genes relacionados ao fenótipo mesenquimal indiferenciado, CD105 (A), OCT-4 (B) e CD166 (C), dos subclones do grupo C-O cultivados sob indução osteogênica (OM) ou não (DMEM). Quadrado ou losângulo e barras em cada período representam média + desvio-padrão. Diferença significativa intergrupo está assinalada por * (p≤0,05) (Teste de Tukey Kramer).
A
B
Figura 9. Variabilidade no padrão de expressão dos genes CD105 (A), OCT-4 (B) e CD166 (C) dos subclones do grupo C-O cultivados sob condição osteogênica (OM) ou não (DMEM) e analisados pela técnica do real time PCR.
A
B