RESULTADOS DA ANÁLISE DE VIABILIDADE CELULAR

Inicialmente foram realizados ensaios preliminares para verificar quais corantes apresentariam melhores resultados nos testes de viabilidade celular, conforme descrito no item 4.5.1.

4.5.1. Ensaios preliminares

Conforme descrito no item 3.4.6, os testes foram conduzidos em incubador rotativo com células em fase de crescimento (inóculo) e em fase de produção de retamicina. Foram testados como corantes o azul de metileno e a fucsina, que tingem células não viáveis e a violeta de genciana, que não tinge células ocas. Os resultados encontram-se nas figuras 4.51 e 4.52. Nestas figuras, as imagens b e d referem-se a uma amostra retirada do mesmo erlenmeyer de onde foram colhidas as amostras referentes às imagens a e c, porém após esterilização em autoclave a 1200C por 20 minutos. Os resultados obtidos não foram coerentes com o reportado na literatura. Não foi possível identificar diferenças entre as células viáveis e não-viáveis antes e depois da esterilização, quando coradas com azul de metileno e fucsina (figura 4.51). Igualmente o uso de violeta de genciana não apresentou esta diferença, principalmente comparando-se a figura 4.52b (inóculo esterilizado) com as demais.

Figura 4.51. Teste de viabilidade celular com azul de metileno e fucsina: a) inóculo; b) inóculo após esterilização; c) em fase de produção; d) em fase de produção, após esterilização.

a

b

Figura 4.52. Teste de viabilidade celular com violeta de genciana: a) inóculo; b) inóculo após esterilização; c) em fase de produção; d) em fase de produção, após esterilização.

4.5.2. Corante BacLightTM

Conforme descrito no item 3.4.6.1, as análises preliminares da viabilidade celular serviram para desenvolver a metodologia com o corante BacLightTM. Foram realizados cultivos em incubador rotativo nas condições de preparo do inóculo (visando obter células viáveis) e de produção de retamicina (fim da fase de crescimento). Foram também analisadas amostras depois de decorridas 24h a mais de incubação. Os melhores resultados obtidos até agora são apresentados na figura 4.53.

A figura 4.53a foi obtida a partir da suspensão de células na forma usada para inocular o biorreator, podendo-se perceber que a região central do objeto é vermelha e,

a

b

portanto, não viável, em contraste com a parte externa na cor verde (viável). Portanto a quase totalidade é viável no início do cultivo. Este mesmo erlenmeyer permaneceu mais 24h em cultivo, e o objeto fotografado (figura 4.53b) continua a apresentar coloração predominantemente verde. As figuras 4.53c e 4.53d foram obtidas de células incubadas em incubador rotativo na forma descrita como teste de produção (item 3.3). Como na figura 4.53a, a parte central do objeto da figura 4.53c é vermelha e a externa verde, indicando alta viabilidade celular. O objeto, pellet ou clump, na figura 4.53d, obtido depois de mais 24h de incubação, é completamente vermelho, indicando sua inviabilidade. Esta avaliação preliminar permite concluir que o inóculo contém uma maior porcentagem de células viáveis, em relação àquelas em fase de produção de retamicina.

Convém esclarecer que lamentavelmente não foi possível prosseguir com estas análises, pois o processo de importação dos filtros de fluorescência atrasou consideravelmente. Estes filtros servem para filtrar a luz verde ou vermelha, simplificando o processo de medição da área celular tingida e permitindo sua quantificação (% da área celular viável).

De todos os corantes utilizados, o LIVE/DEAD® BacLight TM foi o que permitiu uma melhor diferenciação entre células viáveis e não viáveis, conforme ilustra a figura 4.53.

Figura 4.53. Análise da viabilidade celular com corante LIVE/DEAD® BacLightTM.

A _B

5. CONCLUSÕES

1. O planejamento fatorial permitiu avaliar a influência das três variáveis, freqüência de agitação (N), concentração de oxigênio dissolvido (OD) e velocidade específica de crescimento (µ) sobre as variáveis de interesse no processo de produção de retamicina em cultivo contínuo em estado estacionário.

2. O processo de produção de retamicina por Streptomyces olindensis ICB20 foi fortemente influenciado pela velocidade específica de crescimento, sendo as outras variáveis de menor importância nos intervalos testados. Maiores concentrações, produtividades e fatores de conversão de retamicina foram obtidos para o menor valor de (0,05 h-1_{), típico de processo para obtenção de metabólitos secundários e menores}

valores de N (300 rpm).

3. Maiores produtividades em biomassa foram obtidas para o maior valor de (0,25 h-1) e menores valores de N (300 rpm).

4. O cálculo do fator de conversão de substrato em células corrigido levando- se em conta a utilização do extrato de levedura como fonte de carbono é mais coerente que o calculado sem correção, sendo igual a 0,38 ± 0,05 g.g-1.

5. Os coeficientes de variação calculados para os nove ensaios no ponto central foram iguais a 13%, 30% e 13% para a concentração celular, de retamicina e de glicose, respectivamente. Estes valores podem ser considerados baixos para a biomassa e a glicose e elevado para a retamicina.

6. Foi proposto um modelo fenomenológico entre a concentração de retamicina e a frequência de agitação (N) e a velocidade específica de crescimento (µ) obtendo-se um coeficiente de correlação R2 = 0,97, considerando-se todos os ensaios realizados:

Retc = (1005/N) * exp(-12,79 * µ)

7. O teste de atividade biológica permitiu avaliar a ação da retamicina sobre o microrganismo teste. A correlação obtida foi:

Ret (UA) = 0.2887 * – 1,4415 (R2 = 0,93)

8. Não houve influência dos fatores N, OD, e suas interações nos limites abrangidos neste projeto sobre a porcentagem em área de pellets e clumps; houve influência da velocidade específica de crescimento ( ), da freqüência de agitação (N), da interação entre estes fatores e da interação entre os três fatores sobre a porcentagem de hifas.

9. Não houve influência dos fatores N, OD, e suas interações nos limites abrangidos neste projeto sobre a área média das hifas, dos pellets e dos clumps.

10. Os coeficientes de variação calculados para a porcentagem em área para os ensaios PC1, PC4, PC5 e PC6 foram iguais a 36% para as hifas, 100% para os pellets (elevados) e 23% (médio) para os clumps.

11. Combinando-se o modelo fenomenológico ao estatístico para a porcentagem de hifas em unidades não codificadas obteve-se uma correlação entre a morfologia na forma de aglomerados (pellets + clumps) e a velocidade específica de crescimento com a concentração de retamicina:

Retc = ) * 116 % 83 ( ) * 100 34 ( µ µ + − + AGL * exp(-12,79* ) (R 2 _{= 0,95)}

13. Obteve-se uma correlação entre a área média dos aglomerados e a produtividade específica de retamicina (Pret / X):

Pret / Xc = 0,015 *

AM AM 3,75)

( − _{+ exp(-0,3 * (AM – 3,75)}2 _R2 _{= 0,8}

14. O teste de viabilidade celular com o corante BacLight permitiu identificar partes do microrganismo viáveis.