A B
Figura 17- Ilustração da FISH com sonda a LSI BCR/ ABL Dual C, Dual F, Trans. Em A e B, casos normais com presença de dois sinais vermelhos e dois sinais verdes. (Captura realizada em sistema computadorizado Applied Imaging. Aumento: 100X).
C D
Figura 18- Ilustração da FISH com sonda a LSI BCR/ ABL Dual C, Dual F, Trans. Em C e D, casos alterados com uma fusão representando a t(9;22), um sinal verde e um sinal vermelho. (Captura realizada em sistema computadorizado Applied Imaging. Aumento: 100X).
6 DISCUSSÃO
A LMC é uma neoplasia com curso clínico heterogêneo que varia a depender da fase da doença. Todo o avanço tanto no diagnóstico mais precoce, quanto na melhora da conduta terapêutica desses pacientes, tem estimulado muitos estudos na busca do aperfeiçoamento do conhecimento acerca de todos os mecanismos envolvidos na transformação maligna da célula. Nesse contexto as alterações cromossômicas possuem grande importância e são consideradas fundamentais na gênese e evolução do quadro.
São diversas as estratégias de análise genética das células leucêmicas e estas incluem além da citogenética clássica e da técnica de FISH, a técnica de polymerase chain reaction (PCR), a reverse transcriptase - polymerase chain reaction (RT-PCR), a comparative genomic hybridization (CGH), entre outras. Nesse trabalho foi utilizada a técnica de FISH aliada à citogenética clássica no monitoramento de pacientes com LMC em terapia com TKI. Essas técnicas permitem a detecção do rearranjo BCR-ABL e do cromossomo Ph, fundamentais para o diagnóstico e prognóstico da LMC.
As alterações mais comuns nessa patologia e as técnicas utilizadas para identificá-las já foram demonstradas em muitos trabalhos na literatura, entretanto a realização desse estudo ganha importância em decorrência da carência de dados e pesquisas nesta área em nosso Estado. Com os dados obtidos no presente estudo objetiva-se fortalecer as nossas bases em pesquisa, atentando para a assistência, auxílio diagnóstico, capacitação técnica e científica, além de permitir um diagnóstico mais específico dos pacientes.
A Tabela 1 sumarizou os dados clínicos como o sexo, idade e fase da doença em que o paciente desse estudo estava no momento do diagnóstico da LMC, mostrando discreta predominância do sexo masculino, corroborando com dados apresentados na literatura (GIGLIO e BOLLMANN, 2011; BORTOLHEIRO e CHIATTINE, 2008). A faixa etária mais atingida pela LMC, segundo Ferdinand et al., 2012 varia entre 45 a 55 anos com média de 66 anos, entretanto esse estudo demonstrou uma variação entre 20 e 65 anos, com média de 43,6 anos. De acordo com a fase da doença no momento do diagnóstico, houve uma predomínio da fase crônica em relação à fase de aceleração,
corroborando com dados apresentados no estudo realizado por Vendrame-Goloni et al, 2006.
A análise clássica, embora mais demorada e dependente da obtenção de metáfases em boas condições, tem grande importância. De acordo com Chauffaille, 2008, para que o acompanhamento adequado da resposta dos pacientes à utilização da terapia com TKI seja possível é necessário que se conheça o padrão inicial do cariótipo. Ao diagnóstico existem além do cromossomo Ph clássico, cromossomos Ph com alterações adicionais, variantes simples do cromossomo Ph, evolução clonal ou outras anomalias (CORTES et al., 2003), que são importantes para o monitoramento desses pacientes.
A Tabela 2 mostra os dados obtidos dos prontuários em relação ao resultado da citogenética clássica e o inibidor utilizado ao diagnóstico. Todos apresentavam o cromossomo Ph, dados que coincidem com os resultados apresentados por Vendrame- Goloni et al, 2006. Esses pacientes foram tratados inicialmente com o imatinibe, um inibidor de TK de primeira escolha, que segundo Negrine e Schiffer, 2012, é considerado muito eficiente no tratamento inicial para a maioria dos pacientes em fase crônica. Os pacientes que foram diagnosticados já em fase acelerada também receberam o imatinibe, pois os inibidores de segunda geração devem ser administrados somente quando não existir resposta citogenética (KANTARJIAN et al., 2008).
Somente em um dos casos (5%), o caso 13, além do clone Ph positivo verificou-se a presença de outro clone com trissomia do cromossomo 8, dado que coincide com o estudo realizado por Alimena et al., 2006, que relatou que a detecção da evolução clonal apresenta correspondência clínica com a progressão da doença para fase acelerada ou crise blástica e está presente em 7% dos casos de LMC ao diagnóstico.
A resposta ao tratamento é dependente do tempo em que o TKI esta sendo administrado. Dos pacientes selecionadas para esse trabalho, com exceção do caso 6, todos estavam em tratamento a mais de 12 meses. Dos que iniciaram o tratamento com o imatinibe e estavam em uso a mais de 18 meses, 77,8% apresentaram resposta citogenética maior (RCM), corroborando com os dados do estudo de O’Brien et al, 2003. Este comparou o imatinibe com o interferon associado à citarabina em pacientes com LMC ainda não tratados e demonstrou que a taxa estimada de RCM aos 18 meses era de 87,1% para o
grupo do imatinibe e de 34,7% no grupo que recebeu interferon e citarabina, comprovando a eficácia desse fármaco quando administrado ao diagnóstico.
O inibidor utilizado no momento da coleta de medula óssea para a análise desse estudo e os resultados da citogenética clássica durante tratamento estão representados na Tabela 3, revelando dados importantes para entender a evolução citogenética após tratamento com TKI. Destes, 12 pacientes (60%) apresentaram RCM e 4 (20%) ainda não apresentavam resposta ao tratamento (ABREU e LOPES, 2009). Os casos 2, 3, 5 e 19 (20%) não foram avaliados quanto à evolução por apresentarem resultado inconclusivo na técnica clássica, devido ausência de crescimento celular ou impossibilidade de análise, o que foi observado também em outros estudos.
Os pacientes que iniciaram o tratamento com imatinibe passaram a usar o dasatinibe devido à falha terapêutica ou intolerância. Os pacientes refratários, que falharam ao tratamento inicial, foram avaliados após 12 meses, conduta que coincidem com a apresentada por Pagnano, 2008. Destes pacientes, 3 (50%) apresentaram RCM, 1 (16, 7%) apresentou resposta citogenética parcial e 2 (33, 3%) apresentaram resultado inconclusivo pela ausência de crescimento celular (DELAMAIN e CONCHON, 2008 )
Segundo Chauffaille , 2009, os pacientes que não respondem ou apresentam intolerância ao imatinibe e ao dasatinibe passam a utilizar a terceira opção de tratamento, o nilotinibe, e apresentam RCM, o que também foi observado no presente estudo onde 100% dos pacientes tratados com nilotinibe apresentaram citogenética clássica normal. Tanto o dasatinibe quanto o nilotinibe são muito eficazes em pacientes resistentes ao imatinibe, exceto naqueles portadores da mutação T315I, e também em pacientes resistentes por mecanismos independentes da mutação BCR-ABL (ABREU e LOPES, 2009).
Os resultados das análises da citogenética molecular (FISH) estão sumarizados na Tabela 5. Em todos os casos a técnica possibilitou um diagnóstico, estabelecendo resultado nas análises e demonstrando sua especificidade. Os casos 2 e 5 não apresentaram o rearranjo BCR-ABL, entretanto a FISH foi importante para estabelecer um diagnóstico, pois por falta de crescimento celular, logo impossibilidade de análise, obtiveram resultado inconclusivo na técnica convencional. Os casos 3 e 19 também
foram inconclusivos na técnica clássica, entretanto revelaram um percentual consideravelmente elevado de rearranjo BCR-ABL, 16,5% e 13% respectivamente (Tabela 6), demonstrando que a FISH foi fundamental para estabelecer a conduta terapêutica a ser adotada nesses pacientes.
Nos casos 1, 6 e 11 a análise molecular concordou com os achados na técnica convencional, entretanto foi importante para concluir de maneira mais segura o resultado, pois, mesmo após alteração do inibidor inicialmente utilizado, esses pacientes ainda apresentavam o cromossomo Ph e, de acordo com Chauffaille 2008, a FISH é fundamental em casos de resistência ao tratamento quando pode evidenciar reaparecimento do rearranjo ou mesmo mais de uma cópia por ocasião da amplificação da fusão gênica.
O caso 7 apresentou resultado normal na técnica convencional, entretanto ao ser analisado pelo método molecular revelou a presença de 18% de rearranjo BCR-ABL (Tabela 6), demonstrando a importância de aliar o diagnóstico molecular ao clássico. Segundo Chauffaille, 2008, na ausência do cromossomo Ph em caso clinicamente compatível com LMC se tornam necessária a investigação do rearranjo BCR-ABL por métodos moleculares, tais como, FISH ou PCR, já que o mesmo pode estar presente na ausência de alteração cromossômica quando essas células não entram em divisão e, por conseguinte, o clone não pode ser detectado pelo método convencional.
Desse modo, este trabalho demonstrou a importância da associação das técnicas citogenéticas clássica e molecular (FISH) no acompanhamento de pacientes com LMC em tratamento com TKI. Tendo em vista as limitações desse estudo, novos trabalhos que possibilitem uma avaliação mais completa se fazem necessários para comprovar os resultados aqui apresentados.
7 CONCLUSÃO
Na LMC existem algumas alterações genéticas que surgem a depender da fase da doença e são identificadas no estudo genético. Nas últimas décadas, a análise citogenética tem se tornado crucial na conduta de pacientes com essa patologia, uma vez que permite o diagnóstico, análise da evolução do quadro, acompanhamento mais direcionado e a definição terapêutica, o que resulta em uma conduta mais específica e sensível por apresentarem as vantagens e desvantagens das duas análises.
A técnica citogenética detectou 20% de alterações cromossômicas, o que pode ser explicado pela dificuldade em obter metáfases e devido a essa dificuldade, 4 pacientes apresentam resultado inconclusivo. É uma técnica mais trabalhosa e requer qualificação profissional, pois a identificação dos cromossomos não é simples. A Hibridação in situ Fluorescente (FISH) possibilitou resultado em 100% dos casos, sendo que 90% apresentaram o rearranjo estudado, é mais rápida, com maior especificidade e resolução muito específica, mas não possibilita a identificação de outras alterações.
Esse trabalho compreende o primeiro passo para um entendimento mais completo acerca do perfil epidemiológico e molecular dos pacientes com LMC no Estado da Bahia, entretanto seria de grande importância um estudo com maior número de pacientes com mais situações clínicas, a fim de proporcionar melhor avaliação e permitir a definição de orientações mais eficientes. A padronização das técnicas utilizadas é um avanço importante para o Estado da Bahia, pois além de tornar possível a resolução de casos críticos, supre uma necessidade local da utilização dos recursos dessas técnicas no estudo de muitas outras doenças onco-hematológicas.
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APÊNDICE B-Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Você está sendo convidado a participar voluntariamente do projeto de pesquisa “Análise Citogenética e Molecular (FISH) de pacientes com Leucemia Mielóide Crônica em terapia com Inibidores de Tirosino quinase no Estado da Bahia.” Caso tenha mais do que 18 anos, leia atentamente as informações a seguir antes de dar seu consentimento. Em caso de dúvida peça esclarecimento e só assine após ter certeza sobre todas as informações. Desde logo fica garantido o sigilo das informações. Em caso de recusa você não será penalizado (a) de forma alguma.
INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA
Título do Projeto: Análise Citogenética e Molecular (FISH) de pacientes com Leucemia