Resultados e Discussão

3.1. Obtenção e caracterização da FbP

Após coleta do látex em solução tampão, obtivemos um material de aspecto leitoso, que foi processado para remoção de componentes não proteicos, sobretudo a borracha. Com o processamento, obtivemos um material translúcido de coloração levemente amarelada, que foi denominado extrato proteico do látex (EPL). O EPL foi inicialmente fracionado com sulfato de amônio e obtivemos duas frações proteicas, a F30-60 e F60-90, com recuperação de 17% e 62% do total de proteínas, respectivamente (Tabela 1).

A atividade proteolítica do EPL foi verificada na F30-60, mas foi maior na fração F60-90 (Tabela 1). Por ter apresentado maior atividade proteolítica, a F60-90 foi novamente fracionada por cromatografia (CM-Cellulose) (Figura 2SA). Das três frações cromatográficas obtidas, a atividade proteolítica foi maior na fração eluída

com 50 mM de NaCl, assim, a fração foi nomeada FbP (de, Ficus benjamina Protease) (Figura 2SB).

Tabela 1. Teor de proteínas e atividade proteolítica das amostras proteicas obtidas a partir do látex de Ficus benjamina

Amostra proteica Proteína Total (mg) Atividade proteolítica (UA/mL/mgP) EPL 121,6 ± 4,6 A 43.471,1 ± 4760,2 B F30-60 21,2 ± 0,7 C 13.245,9 ± 3217,0 C F60-90 75,7 ± 1,0 B 57.857,5 ± 5997,4 A FbP 1,23 ± 0,3 D 36.393,8 ± 6.878,3 B

Na coluna, médias seguidas de letras iguais não diferem significativamente (p > 0,05) pelo teste de Tukey. EPL: extrato proteico do látex; F30-60: fração obtida pela precipitação do EPL com a saturação 30-60% de sulfato de amônio; F60-90: fração obtida pela precipitação do EPL com a saturação 60-90% de sulfato de amônio; FbP: Ficus benjamina protease, fração obtida pelo fracionamento cromatográfico da F60-90 eluída com 50 mM de NaCl.

A análise qualitativa em gel de poliacrilamina (SDS-PAGE 12%) mostrou que a FbP apresenta uma banda proteica majoritária com massa entre 20 e 30 kDa (Figura 1). Por espectrometria de massas, a proteína teve massa molecular estimada em 23,972 kDa. Os peptídeos gerados pela hidrólise da FbP mostraram similaridade apenas com proteases cisteínicas vegetais (Tabela 2).

Figura 1. SDS-PAGE (12%) das frações utilizadas para obtenção da FbP. EPL: extrato proteico do látex; F60-90: fração obtida pela precipitação do EPL com a saturação 60-90% de sulfato de amônio; FbP: Ficus benjamina protease, fração obtida pelo fracionamento cromatográfico da F60-90 eluída com 50 mM de NaCl; M: marcador molecular (KDa).

Tabela 2. Similaridade da FbP com outras proteases cisteínicas de plantas Acesso Cobertura a (%) #Peptídeosb #Únicoc Massa média (kDa) Descrição _ _ _ _ 23,972 FbP - Protease cisteínica de Ficus benjamina gi|565443889 8 6 2 41,602 Proteína hipotética CARUB_v10005061mg [Capsella rubella]gi|482552647|gb|EOA168 40.1| proteína hipotética CARUB_v10005061mg [Capsella rubella] gi|186516984 _{7 5 0 41,639}

Protease cisteínica1 [Arabidopsis

thaliana]gi|15290508|gb|AAK922

29.1| Protease cisteínica [Arabidopsis thaliana] gi|332661313|gb|AEE86713.1| protease cisteínica1 [Arabidopsis

thaliana]

gi|297802228 7 6 1 41,547

Protease cisteínica [Arabidopsis

lyrata subsp. lyrata]

gi|297314834|gb|EFH45257.1| Protease cisteínica [Arabidopsis

lyrata subsp. lyrata]

gi|587864551 6 7 2 39,860 Protease cisteínica específica de _{germinação1 [Morus notabilis]}

gi|470105671 5 6 0 42,599 PREDITO: protease cisteínica RD21a-like, parcial [Fragaria

vesca subsp. vesca]

gi|422001787 15 4 1 25,524 Protease cisteínica específica de germinação1, parcial [Raphanus

sativus]

gi|2511689 3 5 0 40,474 Protease cisteínica precursor _{[Phaseolus vulgaris]}

FbP: Ficus benjamina protease, fração obtida pelo fracionamento cromatográfico da F60-90 eluída com 50 mM de NaCl; a: Percentual da sequência da proteína que corresponde à soma dos resíduos presentes nos peptídeos que identificam a proteína; b: peptídeos identificados por MSMS; c: peptídeos que só aparecem identificando a proteína no banco de dados utilizado.

A FbP mostrou ter atividade proteolítica estável na faixa de pH entre 6 e 10 (Figura 2A), quando incubada a 37 °C por 60 minutos. Mesmo sendo acentuadamente reduzida, a atividade enzimática foi verificada em pH mais extremo. A FbP manteve elevada atividade proteolítica na faixa de temperatura entre 40 e 70

Figura 2. Caracterização para pH (A) e temperatura (B) ótimos de atividade da FbP (Ficus benjamina Protease). O ensaio de pH foi realizado a 37 °C utilizando os tampões: fosfato de sódio (pH 6,0); tris-HCl (pHs 8,0 e 10); glicina-NaOH (pH 12). Todos os tampões na concentração de 50 mM. A temperatura ideal foi determinada por meio de ensaios realizados em temperaturas variando 10 °C (10 a 70°C) no pH do ensaio padrão (pH 6,0). A atividade proteolítica nos pHs de 6,0 a 10 não diferiu estatisticamente pelo teste de Tukey (p > 0,05). O asterisco indica maior atividade proteolítica em relação às demais temperaturas (p ≤ 0,05).

3.2. Atividade biológica

A atividade biológica das amostras proteicas foi verificada em teste de desenvolvimento larvar com o EPL, as frações F30-60, F60-90 e a FbP. Os valores de IC50 variaram entre 0,22 a 1,38 mg/mL (Tabela 3). Eficiência em torno de 100%

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 6 8 10 12 A ti vi da de P rot eo lít ica (U A /mL/ mgP ) pH A 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 10 20 30 40 50 60 70 80 A ti vi da de P rot eo lít ica (U A /mL/ mgP ) Temperatura (_°C) B *

foi obtida quando as larvas foram tratadas com 1 mg/mL das amostras EPL, F60-90 e a FbP, o mesmo efeito não foi observado quando as larvas foram tratadas com a amostra de menor atividade proteolítica, a F30-60.

Tabela 3: Eficácia média (% ± DP) e CI50 (IC 95%) das amostras proteicas obtidas do látex de Ficus benjamina na inibição do desenvolvimento de larvas de

Haemochus contortus Concentração (mg/mL) Amostras proteicas EPL F30-60 F60-90 FbP 2,00 100,0 ± 0,0 65,0 ± 12,6 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 1,00 100,0 ± 0,0 40,3 ± 34,0 98,1 ± 1,3 100,0 ± 0,0 0,50 95,0 ± 1,5 10,8 ± 2,5 58,7 ± 13,3 87,3 ± 15,8 0,25 62,1 ± 6,0 11,4 ± 8,5 9,1 ± 1,4 14,0 ± 12,1 0,13 10,3 ± 5,2 0,0 ± 0,0 4,8 ± 5,5 9,0 ± 4,6 IC₅₀ (mg/mL) 0,22 _{[0,21 - 0,23] A} 1,38 _{[0,98 - 2,34] C} 0,42 _{[0,33 - 0,54] B} 0,26 _{[0,20 - 0,32] A}

Na linha, letras iguais não diferem significativamente. DP: desvio padrão; IC: Intervalo de Confiança; CI50: Concentração Inibitória; EPL: extrato proteico do látex; F30-60: fração obtida pela precipitação

do EPL com a saturação 30-60% de sulfato de amônio; F60-90: fração obtida pela precipitação do EPL com a saturação 60-90% de sulfato de amônio; FbP: Ficus benjamina protease, fração obtida pelo fracionamento cromatográfico da F60-90 eluída com 50 mM de NaCl.

4. Discussão

O látex é uma mistura complexa que pode ser uma importante fonte de compostos ativos (Agrawal e Konno, 2009). Neste estudo relatamos a obtenção e caracterização parcial de protease cisteínica obtida do látex de F. benjamina. Outras proteases já foram purificadas a partir do látex de espécies do gênero Ficus, das quais a protease serínica de F. religiosa, a protease aspártica de F. racemosa e a protease serínica colagenolítica de F. carica, são exemplos (Devaraj et al., 2008; Kumari et al., 2010; Raskovic et al., 2014)

A análise de similaridade (Tabela 2) revelou que os peptídeos gerados pela hidrólise da FbP mostraram similaridade apenas com proteases cisteínicas vegetais. A massa molecular de 23,972 kDa da protease, determinada por espectrometria de massas, foi semelhante ao encontrado para proteases cisteínicas de outras plantas, tais como as purificadas do látex de F. carica (24,29 kDa) (Baeyens-Volant, et al.,

2015) e de Pergularia extensa (23,35 kDa) (Shivaprasad et al., 2010). Normalmente, o pH ótimo de proteases cisteínicas é distribuído nas regiões próximas do neutro (Salleh et al., 2006), mas FbP mostrou uma ampla faixa de estabilidade desde levemente ácido (pH 6,0) até em pH mais alcalino (pH 10) sem perda de atividade (Figura 2A). Microcapain, uma protease cisteínica de Ficus microcarpa, também mostrou atividade em ampla faixa de pH, mas parte da atividade foi perdida fora do pH ótimo da enzima (pH 8,0) (Mnif et al., 2015). A FbP também mostrou ter atividade proteolítica em uma ampla faixa de temperatura com atividade ótima a 60 °C (Figura 2B).

Proteases são enzimas que desempenham diversos papéis fisiológicos e de defesa nas plantas (Schaller, 2004). O papel dessas proteínas na ação direta como agente controlador de insetos herbívoros também tem sido sugerido (Mohan et al., 2006). Desde os primeiros relatos que atribuíram às proteases cisteínicas a ação anti-helmíntica do látex, essa classe de proteínas passou a ser investigada quanto ao seu potencial nematicida sobre diversos nematóides parasitos de animais que habitam as diferentes regiões do trato digestório (Robbins, 1930, Berger e Ansejo, 1940, Benke et al., 2008).

Experiências in vitro e in vivo demonstraram a ação eficiente de proteases sobre nematóides gastrointestinais adultos. No presente estudo, demonstramos que essa classe de enzima também é capaz de exercer efeito anti-helmíntico sobre larvas. Tanto a FbP, quanto as outras frações proteicas foram capazes de exercer efeito inibitório sobre o desenvolvimento de larvas com IC50 de 0,22, 1,38, 0,42 e 0,26 mg/mL para o EPL, F30-60, F60-90 e FbP, respectivamente. Possivelmente a atividade do EPL e das frações F30-60 e F60-90 também foi mediada por proteases, pois os menores valores de IC50 foram obtidos das amostras com maior atividade proteolítica (Tabelas 1 e 3), no entanto, estudos posteriores precisam ser realizados para confirmar essa hipótese.

Uma vez que são enzimas catalisadoras da hidrólise de ligações peptídicas, esta capacidade hidrolítica pode ser responsável pelas propriedades anti-helmínticas das proteases cisteínicas. Análises microscópicas de nematóides adultos tratados com protease cisteínica de várias plantas mostraram que a enzima age na cutícula protetora dos parasitos degradando e tornando-a enfraquecida o suficiente para que

a pressão hidrostática interna do corpo desintegre o nematóide (Stepek et al., 2006; Stepek et al., 2007).

Experiências in vivo demonstraram que suínos infectados que foram tratados com administração oral de látex de C. papaya apresentaram redução na carga de

Trichuris suis com eficiência semelhante à obtida com alguns anti-helmínticos do

mercado (Levecke et al., 2014). A administração oral do látex de C. papaya em ovelhas infectadas mostrou eficiência no controle do nematóide H. contortus (do abomaso), mas não sobre Trichostrongylus colubriformis (do intestino delgado) possivelmente devido à localização do parasito que tem parte do corpo inserida na mucosa intestinal, onde o contato com a enzima pode ser reduzido, corroborando com o mecanismo de ação sugerido para protease cisteínica, no qual a enzima precisa estar em contato com a cutícula para exercer efeitos deletérios (Buttle et al, 2011). Nos estudos supracitados, eficiência nematicida do látex foi atribuída à presença das proteases cisteínicas. O bloqueio da ação anti-helmíntica do látex in

vitro pelo uso de inibidores de protease cisteínica reforça a hipótese de que o

principio ativo do látex são as proteases (Stepek et al., 2007).

Em uma perspectiva para utilização in vivo, a FbP mostrou características vantajosas, como atividade estável em uma ampla faixa de pH e temperatura (Figura 2), podendo suportar a passagem pelas câmaras pré-estomacais dos ruminantes para atuar no abomaso, habitat de H. contortus. O Abomaso corresponde ao estômago glandular dos ruminantes, e sob condições normais tem pH ácido (2-3), mas a infecção por H. contortus pode elevar o pH abomasal a valores próximos do neutro (6-7), faixa de atuação ótima da FbP (Nicholls et al, 1989; Buttle et al, 2011).

Apresentamos aqui uma protease cisteínica que interfere negativamente no desenvolvimento de larvas do nematóide gastrointestinal H. contortus, caracterizando-se como uma potencial alternativa para o desenvolvimento de produtos a serem utilizados em programas de controle desse parasito.

Referências

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Material suplementar

Figura 1S. Obtenção do extrato do látex, das frações proteicas e da FbP a partir do látex de Ficus benjamina.

A B

Figura 2S. Perfil de eluição da fração sulfato de amônio 60-90% em coluna de CM- Cellulose a um fluxo de 0,8 mL/min. As proteína retidas foram eluídas com 50 mM e 100 mM de NaCl e as frações foram denominadas FbP e F100, respectivamente, e a fração não retida foi nomeada FNR (A). Atividade proteolítica das frações cromatográficas (B). O asterisco indica maior atividade proteolítica entre as frações cormatográficas (p ≤ 0,05). 0 20 40 60 80 100 120 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1 _{41 81} 121 161 201 241 281 321 361 401 441 481 [ ] Na Cl A bs (2 80 nm ) Fração (0,8 mL) 3738,7 36393,8 19683,5 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 FNR FbP F100 A tiv id ad e p ro te o lí tica (UA /m L/m g P) Frações cromatográficas *

CAPÍTULO IV _{– SHORT REPORT}

Efeito antimicrobiano de protease cisteínica do látex de Ficus benjamina

Resumo

A atividade antimicrobiana de protease cisteínica e de extratos proteicos do látex de

Ficus benjamina foi avaliada in vitro sobre as bactérias patogênicas Salmonella enterica, Staphylococcus aureus e Enterobacter aerogenes. O látex foi obtido por

exsudação após incisão no ápice do galho das plantas. Para remoção da borracha, o material foi centrifugado, dialisado contra água, novamente centrifugado e, então, nomeado extrato proteico do látex (EPL). As frações de proteína foram obtidas por precipitação do EPL com sulfato de amônio nas saturações 30-60 e 60-90% para obtenção das frações F30-60 e F60-90, respectivamente. A fração de protease (FbP) foi obtida por fracionamento cromatográfico da F60-90 em matriz de CM- Cellulose. A atividade biológica foi avaliada por testes de inibição do crescimento bacteriano em meio líquido. A FbP mostrou efeito inibitório sobre o crescimento das bactérias S. enterica e S. aureus com concentração mínima de inibição (MIC) de 3,12 µg/mLpara ambas as bactérias. Conclui-se que o látex de F. benjamina tem protease cisteínica com efeito inibitório sobre o crescimento das bactérias patogênicas podendo ser uma potencial alternativa para o controle das bactérias S.

enterica e S. aureus

Palavras-chave: Fitoterapia, proteína, antibacteriano, pecuária.

1. Introdução

A infecção dos animais de produção por agentes patogênicos tem importantes implicações, porque além de causarem diminuição na produtividade dos animais, esses microorganismos podem ser transmitidos ao homem através do consumo de produtos oriundos de animais contaminados (Chiu et al., 2004; Sharma et al., 2005).

Alimentos de boa qualidade e livres de microorganismos patogênicos tem se tornado uma exigência do mercado no mundo todo. No entanto, o surgimento de cepas multirresistentes aos princípios ativos dos medicamentos antibióticos tem dificultado o tratamento de infecções microbianas (Schwartz e Chaslus-Dancla, 2001).

A resistência bacteriana é uma realidade que atualmente se configura em uma das maiores preocupações para a medicina humana e veterinária. Esse fenômeno ocorre naturalmente, mas pode ter sido acelerado pela pressão seletiva com o uso indiscriminado e muitas vezes inadequado dos medicamentos (Witte, 2000; Arias e Carrilho, 2012). Se o controle microbiano é necessário para o sucesso da pecuária, ele deve ser feito de forma consciente, considerando-se os múltiplos aspectos que levam ao surgimento da resistência.

A busca por soluções eficazes para o controle de microorganismos tem impulsionado a pesquisa científica a identificar compostos de origem biológica que possam ser eficientes e ao mesmo tempo seguros para homens, animais e para o ambiente. A atividade antibacteriana de extratos vegetais é reportada para diferentes gêneros de bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e bactérias multirresistentes (Al Akeel et al., 2014; N'guessan et al., 2007; Farooqui et al., 2015). No entanto, na maioria desses trabalhos a ação é atribuída aos compostos do metabolismo secundário das plantas.

Ficus é um gênero de plantas da família Morcaceae com muitas espécies que

são utilizadas na medicina popular para diversos fins terapêuticos (Ahmed e Urooj, 2010; Singh e Jaiswal, 2014). Recentemente, foi identificada em Ficus drupacea a presença de metabólitos com ação antibacteriana, antifúngica e anticâncer (Yessoufou, et al., 2015). Neste trabalho, avaliamos o potencial antibacteriano de constituintes proteicos do látex de Ficus benjamina sobre as bactérias patogênicas

Salmonella enterica, Staphylococcus aureus e Enterobacter aerogenes.

2. Material e Métodos

2.1. Obtenção das proteínas solúveis do látex

O látex foi obtido a partir de plantas adultas encontradas no campus I da Universidade Federal do Maranhão, São Luís MA, Brasil (2°33’13.3’’S

44°18’20.2’’W). A exsicata do material vegetal foi depositada no Herbário Ático Seabra da Universidade Federal do Maranhão sob o número de registro 1457 no ano 2016. Após incisão no ápice do galho das plantas, o látex exsudado foi dissolvido em tampão fosfato de sódio (75 mM, pH 7,0) sempre mantido em banho de gelo. Para remoção da borracha, o látex foi centrifugado a 12.000 x g a 4 °C por 15 minutos, dialisado contra água (cut-off 14 kDa) e novamente centrifugado sob as mesmas condições anteriores. Depois do procedimento acima descrito, o sobrenadante obtido foi denominado extrato proteico do látex (EPL).

2.2. Determinação do teor de proteínas

As proteínas solúveis totais foram determinadas pelo método de Bradford (1976). Uma curva padrão foi construída com concentrações conhecidas de albumina sérica bovina (BSA) para determinação da concentração protéica.

2.3. Fracionamento por precipitação com sulfato de amônio

As proteínas do EPL foram separadas em duas frações pela saturação com 30- 60% e 60-90% de sulfato de amônio (SA) e nomeadas de F30-60 e F60-90, respectivamente. Em banho de gelo, o SA foi adicionado lentamente ao EPL e após a completa solubilização, a mistura permaneceu em descaso por 12 horas. A mistura foi centrifugada a 15.000 x g por 30 minutos a 5 °C. O precipitado foi ressuspendido e dialisado contra água para remoção do SA. O sobrenadante foi utilizado para a próxima saturação.

2.4. Obtenção da fração protease

A fração de protease cisteínica do látex de F. benjamina foi obtida pelo fracionamento cromatográfico da F60-90. A amostra proteica foi aplicada em uma coluna cromatográfica de troca iônica (matriz de CM-Cellulose) previamente equilibrada com tampão acetato de sódio (50 mM, pH 5,2) a um fluxo de 0,8 mL/min. A fração eluída com 50 mM de NaCl, denominada FbP, apresentou uma banda

proteica majoritária que foi identificada por espectrometria de massa como protease cisteínica com 23,97 kDa.

2.5. Ensaio de inibição do crescimento bacteriano

A atividade antibacteriana das frações proteicas e da FbP foi verificada de acordo o método de inibição de crescimento em meio líquido como descrito por Hancock (2000). A atividade antibacteriana foi avaliada para as bactérias Gram- negativas Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium (ATCC 14028) e

Enterobacter aerogenes (ATCC 13048) e a Gram-positiva Staphylococcus aureus

(ATCC 25923). As bactérias, previamente repicadas em meio de cultura ágar nutriente, foram transferidas para caldo Mueller-Hinton (5 mL) e incubadas em estufa