O tamanho da região ITS/5.8S do rDNA nuclear de M. capixaba foi estimado em 3650 pb. Resultado similar foi relatado para populações de
Melipona subnitida do nordeste do Brasil, em que a região ITS/5.8S do rDNA
nuclear foi amplificada e as estimativas de tamanho variaram de 3650 a 3700 pb (Cruz et al., 2006).
O tamanho da região tRNA/COI de M. capixaba foi estimado em 1850 pb. Tamanhos similares foram obtidos para sequências tRNA/COI de Melipona
bicolor - 1838 pb (Silvestre et al., 2008 – GeneBank, acesso NC_004529), M. scutellaris e M. quadrifasciata - 1837 pb (Cristiano, 2009 - comunicação
pessoal).
As regiões ITS-1 e ITS2 do rDNA nuclear não são codificadoras e, portanto, são mais variáveis em relação às regiões codificadoras do DNA nuclear. No entanto, as análises preliminares demonstraram que nenhum polimorfismo PCR-RFLP foi detectado quando sequências ITS/5.8S, das operárias de M. capixaba avaliadas, foram digeridas com 50 enzimas de restrição. A não detecção de polimorfismos nessa região sugere, portanto, baixa variabilidade genética na população de M. capixaba analisada.
Em outras espécies de abelhas e até mesmo em outros insetos, polimorfismos genéticos na região ITS têm sido reportados e utilizados para inferências filogenéticas, estrutura populacional e discriminação de espécies.
Ciociola et al. (2001) analisaram 7 espécies do Genero Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) comparando sequências e padrões de restrição da região ITS-2 das mesmas. Com base no tamanho das sequências ITS-2 e na presença ou ausência de sítios de restrição foi construída uma chave molecular simples e precisa que permitiu a identificação dessas vespas.
Cruz et al. (2006) analisaram sequências parciais da região ITS-1 de
Melipona subnitida, abelha endêmica da região nordeste do Brasil, procedentes
de 30 localidades com distâncias geográficas variando de 23 a 737 km e observaram altos níveis de divergência genética entre elas. Segundo o autor, essa alta divergência genética entre as populações pode ser consequência do
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fato de Melipona subnitida estar amplamente distribuída e ser muito antiga na região.
No caso de M. capixaba, neste estudo, a baixa distância geográfica entre os locais de coleta pode estar contribuindo para a baixa variabilidade genética observada.
A região ITS-1 foi utilizada por De La Rúa et al. (2007a) em estudos filogenéticos e populacionais com subespécies de Apis mellifera. A comparação entre as sequências obtidas permitiu discriminar A. m. scutellata
de A. m. intermissa. Essas duas subespécies exibem distribuição norte e sul da
África, respectivamente.
Apesar de nas análises preliminares nenhum polimorfismo RFLP ter sido detectado para a região ITS/5.8S, antes de descartar a possibilidade de utilização desta região nas análises previstas neste estudo, DNA total de 93 operárias de M. capixaba foi amplificado e digerido com as enzimas HinfI, MspI e TasI. A escolha dessas enzimas foi feita com base nos padrões RFLP obtidos nas análises preliminares. Novamente nenhum sítio polimórfico RFLP foi detectado.
Diante desse resultado, as análises prosseguiram analisando apenas fragmentos PCR obtidos por amplificação da região tRNA/COI de M. capixaba. Em contraste ao resultado obtido com análises da região ITS-5.8S, polimorfismos foram identificados quando a região tRNA/COI de 12 operárias de M. capixaba foi digerida com as enzimas de restrição DraI, HinfI, KspAI,
MspI ou SspI.
Os produtos da amplificação da região tRNA/COI de 93 operárias de
M. capixaba foram, então, digeridos com as enzimas DraI, HinfI, KspAI, MspI e SspI. Os padrões PCR-RFLP (Figura 6) foram analisados e 8 haplótipos
mitocondriais foram observados (Tabela 2). A distribuição geográfica dos haplótipos, das 93 amostras de M. capixaba analisadas, está representada na Figura 7A e o local de coleta de cada amostra está descrito na Tabela 5 do Anexo.
Essa distribução geográfica de haplótipos mitocondriais identificados para M. capixaba demonstra uma estruturação haplotípica onde cada haplótipo, exceto os denominados II, VI e VIII, encontra-se com mais frequência em uma dada região geográfica.
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Figura 6 – À esquerda: Esquema dos padrões PCR-RFLP obtidos por digestão da
sequência tRNA/COI do DNA de 93 amostras de M. capixaba com as enzimas DraI,
HinfI, KspAI, MspI e SspI. I a VIII representam os 8 haplótipos mitocondriais
identificados. À direita: Perfil eletroforético dos padrões obtidos. A, B, C e D: Padrões RFLP. *: DNA sem digerir. M: marcador de peso molecular 100 pb plus (Fermentas) para MspI e 1 kb (Invitrogen) para as demais enzimas. Fragmentos menores que 50 pb não foram considerados.
Tabela 2 – Haplótipos mitocondriais de M. capixaba
identificados
Haplótipo Padrões RFLP tRNA/COI
DraI HinfI KspAI MspI SspI I A B A B B II A A A A C III B B A B B IV A A A A A V B A A A C VI A A A A D VII B A B A C VIII B A A B C
Haplótipos com ampla distribuição na região amostrada, como é o caso dos haplótipos I, II e V, também são observados. Os haplótipos I, IV e V foram os mais frequêntes, abrangendo 81 % das amostras analisadas (Figura 7C). Os haplótipos II, III, VI, VII e VIII foram os menos frequentes sendo o haplótipo VIII detectado exclusivamente na amostra de número 92. A extinção de colônias de M. capixaba por predadores (incluindo meleiros), desmatamento
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e/ou até mesmo a não amostragem podem ter contribuído para a baixa frequência observada para estes haplótipos.
Não é possível identificar com precisão qual haplótipo mitocondrial é o ancestral, por não saber ao certo qual o rumo da evolução. Contudo, considerando que a probabilidade de se perder um sítio de restrição é maior do que a de ganhá-lo, pois a substituição de um único nucleotídeo já é o suficiente para que a enzima não reconheça o sítio, os haplótipos possivelmente ancestrais seriam aqueles determinados pelos maiores números de sítios reconhecidos pelas enzimas (Arias e Infante-Malachias, 2001). Desta forma, os haplótipos que apresentam o maior número de “1” (presença de sítio de restrição) na matriz binária podem ser considerados os haplótipos ancestrais. A matriz binária de haplótipos obtida para M. capixaba (Tabela 7 - ANEXO). mostra que os haplótipos II e VII (apresentam 6 dos 7 sítios de restrição que se mostraram polimórficos) seriam então os haplótipos mais antigos seguido pelos haplótipos IV, V e VI (apresentam 5 dos 7 sítios de restrição que se mostraram polimórficos) e haplótipos VIII, I e III (apresentam respectivamente 4, 3 e 2 dos 7 sítios de restrição que se mostraram polimórficos). Assim, parece que a dispersão para a porção mais ao sul da região de ocorrência de M. capixaba (haplótipos I e III na Figura 7A) se deu recentemente.
A projeção tridimensional da distância genética no plano (Figura 7B) apresentou valores de eficiência adequados com níveis de estresse e distorção bem inferiores a 20 % (7,32 e 3,15 % respectivamente). Além disso, a correlação entre distâncias originais e estimadas foi superior a 0,95 (0,99), evidenciando alta correlação entre as distâncias genéticas analisadas e a dispersão gráfica representada.
O gráfico de projeção tridimensional da distância genética no plano (Figura 7B) mostra que os haplótipos tRNA/COI de M. capixaba foram distribuídos em 3 grupos. Um dos grupos formado pelos haplótipos II, V, VI, VII e VIII, outro pelos haplótipos I e III e o terceiro inclui apenas o haplótipo IV. O agrupamento observado corresponde parcialmente com a distribuição geográfica dos 8 haplótipos. Essas análises demonstram que haplótipos geneticamente distantes se encontram lado a lado, como é o caso, por exemplo, dos haplótipos da colônia de número 13 com os das colônias de número 12 e 14.
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Figura 7 – A: Mapa de relevo, adaptado de Miranda (2005), representando a
distribuição geográfica dos 8 haplótipos tRNA/COI detectados na população de M.
capixaba. B: Projeção tridimensional da distância genética no plano sugerindo que,
para algumas amostras, não há correlação entre a distribuição geográfica dos haplótipos e a distância genética. C: Legenda de haplótipos com suas respectivas composição e frequência.
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Agrupamento semelhante foi relatado por Nogueira (2009) ao utilizar projeção tridimensional da distância genética no plano para analisar, por ISSR, 95 amostras de M. capixaba procedentes de 25 localidades da região serrana do Espírito Santo. Correspondência parcial entre projeção tridimensional e distribuição geográfica, também, foi observada por Borges (2007) ao analisar operárias de 66 colônias da abelha sem ferrão Partamona helleri coletadas em 5 localidades do Estado de Minas Gerais.
Figura 8 - Resultado do Teste Mantel mostrando baixa correlação entre distância
genética (com base na matriz binária) e distância geográfica (km). Correlação entre distâncias genéticas e geográficas: r = 0,177. Probabilidade de observar uma correlação maior ou igual à observada: p = 0,0001. Probabilidade de observar correlação menor ou igual à observada: p = 1,0. 1000 replicações foram realizadas.
O Teste Mantel (Figura 8) mostrou magnitude do valor r baixa, apesar de significativa (0,177), evidenciando baixa correlação entre distância genética e geográfica das colônias de M. capixaba. Esse resultado é consistente com observações feitas através da distribuição de haplótipos e da projeção tridimensional da distância genética no plano (Figuras 7A e 7B).
Essa correlação parcial entre distâncias geográficas e genéticas observada na população de M. capixaba, tanto através da comparação entre a projeção tridimensional da distância genética no plano com a distância
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geográfica quanto através do Teste Mantel, tem se mostrado comum quando se trata de meliponíneos, principalmente os localizados na mata atlântica que sofrem grande influência antrópica. Colônias são retiradas das matas por criadores, transportadas de uma região para outra e se tornam semidomesticadas para exploração. Essas colônias, na maioria das vezes, por péssimas condições de manejo, acabam sendo extintas. Há também os meliponicultores, que fazem divisão racional de colônias e promovem seu transporte de uma localidade para outra.
Considerando que a maioria das colônias de M. capixaba se encontra nas mãos de criadores (apenas 9 amostras foram coletadas de colônias em condições naturais), a influência antrópica tem reflexos diretos na dispersão e na perpetuação dessa espécie.
Praticamente os mesmos grupos observados na projeção tridimensional da distância genética no plano foram também observados nos fenogramas obtidos pelos métodos UPGMA (utilizando matriz de distância genética com atribuição de pesos para cada enzima de restrição - Tabela 3) e Dollo parcimônia (utilizando matriz binária dos haplótipos tRNA/COI – Tabela 7 - Anexo) mostrados nas Figuras 9 e 10, respectivamente. Nesses agrupamentos, a população de M. capixaba foi dividida em dois grupos principais. Um dos grupos formado pelos haplótipos I e III e o outro pelos haplótipos II, IV, V, VI, VII e VIII, sendo este último subdividido em dois subgrupos compostos pelos haplótipos II, IV e VI e haplótipos V, VII e VIII.
A Tabela 3, matriz da distância genética entre haplótipos tRNA/COI de
M. capixaba, mostra que a maior distância genética (0,194) foi observada entre
o haplótipo III e os haplótipos IV e VI, enquanto que a menor (0,019) foi observada entre o haplótipo II e os haplótipos IV, V e VI.
Tabela 3 – Matriz da distância genética entre haplótipos tRNA/COI de M. capixaba
com base no número estimado de substituição nucleotídica dos sítios de restrição
I II III IV V VI VII II 0.078 III 0.037 0.119 IV 0.119 0.019 0.194 V 0.119 0.019 0.103 0.047 VI 0.119 0.019 0.194 0.047 0.047 VII 0.138 0.035 0.126 0.063 0.020 0.063 VIII 0.096 0.042 0.074 0.076 0.025 0.076 0.053
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Figura 9 – Fenograma UPGMA de haplótipos mitocondriais de M. capixaba obtido
com base na matriz de distância genética da Tabela 3.
Figura 10 – Fenograma de haplótipos mitocondriais de M. capixaba por Dollo
parcimônia com 10000 repetições e sem atribuição de pesos para enzimas de restrição.
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A rede de haplótipos obtida para M. capixaba (Figura 11) também corrobora com os agrupamentos obtidos pelos métodos descritos acima. Os agrupamentos definidos na rede de haplótipos mostraram baixa divergência genética entre os haplótipos mitocondriais. Apenas dois passos mutacionais separam os dois grupos principais. É possível que outros haplótipos intermediários não tenham sido amostrados e/ou que a ação de meleiros e a retirada de colônias da mata nativa por criadores, somado ao alto grau de fragmentação da região de ocorrência de M. capixaba, tenham acarretado a extinção de haplótipos intermediários.
Figura 11 – Rede de haplótipos tRNA/COI de M. capixaba. Os traços transversais
entre dois haplótipos representam o número de passos mutacionais entre eles. O diâmetro de cada círculo é proporcional à frequência do haplótipo.
Os meliponíneos são altamente suscetíveis ao desmatamento. Brown e Albrecht (2001) mediram a abundância de espécies do Gênero Melipona em
locais com diversos graus de perturbação antrópica em uma área de 3150 km2
da floresta amazônica no Estado de Rondônia e sugeriram que essas abelhas apresentam um grande potencial como bioindicadores. Um dos fatores responsáveis por essa sensibilidade é a presença de um abdome desenvolvido nas rainhas que as impedem de voar. Dessa forma, as colônias são incapazes de fugirem de áreas que sofreram algum tipo de distúrbio, como desmatamentos ou queimadas.
Gouvêa et al. (2007) estudaram o efeito da fragmentação sobre a diversidade de Meliponini no corredor central da mata atlântica. Os autores realizaram coletas mensais em um período de 11 meses na RPPN da
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Michelin/Bahia que compreende uma área de 9000ha localizada no baixo sul desse Estado. Do total de indivíduos coletados (5726), 95 % foram encontrados em áreas de mata primária (fragmentos na escala de centenas e acima de 1000ha) e apenas 5 % em áreas de fragmentos florestados (fragmentos na escala de dezenas de hectares). A riqueza de espécies também foi maior em áreas de mata primária (21 espécies distribuídas em 5 gêneros) do que nas áreas de fragmentos florestados (12 espécies e 4 gêneros). O Gênero
Melipona foi encontrado somente em áreas de mata primária. Os autores
relataram que a ausência deste gênero nos fragmentos florestados pode estar relacionada à falta de árvores de grande porte ou à baixa disponibilidade de cavidades arbóreas naturais requeridas por espécies do Gênero Melipona para nidificação.
Diante do exposto, a preservação da vegetação existente e a recolonização de áreas onde M. capixaba foi extinta são ações fundamentais para conservação dessa espécie.
As colônias de número 91, 92 e 93 foram transportadas da região de Garrafão no município de Santa Maria de Jetibá para a cidade de Santa Tereza. A sobrevivência destas colônias em outra área a qual fica localizada a cerca de 25 km de sua região de origem, mostra que é possível a colonização de M. capixaba em áreas com condições de relevo e clima similares às do entorno de Pedra Azul no município de Domingos Martins. A manutenção de grupos mais distantes pode possibilitar o estabelecimento, mesmo que em longo prazo, de outra unidade evolutiva, fortalecendo a capacidade de sobrevivência da M. capixaba diante dos processos de seleção natural. Além disso, a existência de um haplótipo mitocondrial exclusivo na população amostrada (haplótipo VIII, colônia de número 92) e o transporte desse haplótipo para a região de Santa Tereza onde não foram observadas colônias nativas, pode originar um novo grupo de colônias com diferenciação genética divergente das demais pelo efeito fundador.
A recolonização de outras localidades pode ser feita a partir da divisão racional de colônias de M. capixaba pré-existentes. Luiz Fabio Feitoza Caliman, um meliponicultor do município de Venda Nova do Imigrante, relatou à revista Mensagem Doce (nº 96, maio de 2008) que começou sua criação de M.
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de 94 colônias empregando técnicas de manejo para essa espécie. A Reserva Particular de Patrimônio Natural (RPPN) Oiutrem, única unidade de conservação localizada na área de ocorrência de M. capixaba e primeira RPPN estadual do Espírito Santo, localizada em Matilde no município de Alfredo Chaves, também possui em seu meliponário colônias de M. capixaba com o objetivo de desenvolver técnicas de manejo, reprodução de enxames e produção de mel.
Kerr e Vencovsky (1982) recomendaram um número mínimo de 44 colônias em uma mesma região para uma população de Meliponini ser mantida. Os Meliponini requerem esse número de colônias para manter 6 alelos determinadores do sexo (xo). Quanto maior o número de alelos sexuais, menor é a probabilidade de ocorrerem acasalamentos entre indivíduos idênticos o que prejudicaria o desenvolvimento da colônia com a geração de machos diplóides. Os autores estimaram que a frequência de acasalamentos que resulta em 50 % de machos diplóides para 10 colônias de M.
quadrifasciata em uma mesma região é de 35,97 %, com taxa de 13 % de
possibilidade de eliminação de colônias. Essas estimativas diminuem para 17,33 % e 3 % respectivamente quando há 40 colônias em uma mesma região.
Diante dessas observações, um melhor entendimento da estrutura genética da população de M. capixaba e da influência antrópica nessa estrutura se fez necessário. Para isso, a população de M. capixaba foi dividida em grupos de colônias conforme o tipo e a frequência de determinado haplótipo (Figura 12). Haplótipos compartilhados entre os grupos propostos é claramente observado. Uma possível explicação para esse compartilhamento de haplótipos é a prática comum de transporte de colônias de M. capixaba entre localidades, conduzidas por meliponicultores ou criadores. Um exemplo dessa prática é a translocação das colônias de número 91, 92 e 93 da região do Garrafão no município de Santa Maria de Jetibá para o município de Santa Tereza. A Tabela 5 do Anexo mostra outros exemplos de colônias translocadas. A identificação do local de origem dessas colônias foi feita com base em informações fornecidas por proprietários de colônias de M. capixaba.
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Figura 12: Divisão das amostras de colônias de M. capixaba em grupos para
realização da AMOVA. É demonstrada, de acordo com informações fornecidas pelos proprietários das colônias, a translocação de colônias de M. capixaba entre grupos. As setas partem do grupo de origem (não exatamente o local) apontando para a colônia que foi transportada. As amostras de número 6, 4, 5, 42, 70, 84, 85, 86, 89 foram coletadas de colônias em condições naturais na região amostrada. As colônias de número 91 a 93 têm sua origem nas proximidades das colônias de número 88 a 90 e não foram encontradas colônias nativas na região em que estas últimas foram amostradas. Demais amostras, mesmo as suspeitas de terem sido translocadas, foram consideradas nas análises como sendo sua região de origem a região de coleta das mesmas.
Os grupos formados foram, então, submetidos a duas análises de variânça molecular (AMOVA). Uma das análises foi realizada considerando a região de origem de todas as colônias como sendo a região de coleta das mesmas e a outra, considerando colônias que foram translocadas como sendo procedentes da região de onde foram translocadas e não da região de coleta das mesmas.
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Tabela 4 – Análises de variânça molecular (AMOVA) com base em sítios de restrição
das sequências tRNA/COI de M. Capixaba Transporte
de colônia Fonte de variação GL SQ Estimativa % Antes Dentro dos grupos Entre grupos 88 4 13,217 22,493 0,175 0,266 40,72 59,28
Total 92 35,710 0,431 100
ST = 0,41
Depois Dentro dos grupos Entre grupos 87 5 12,288 23,422 0,151 0,269 35,94 64,06
Total 92 35,710 0,420 100
ST = 0,36
* GL: grau de liberdade. SQ: soma dos quadrados. Estimativa: estimativa dos componentes de variânça. %: porcentagem de variação. p = 0,000 ± 0,000.
Os resultados das análises de variânça molecular mostraram que nas duas condições avaliadas a variação genética estimada foi maior dentro (59,28 e 64,06 % respectivamente) do que entre os grupos (40,72 e 35,94 % respectivamente). Esses resultados, somados à baixa divergência genética observada entre os 8 haplótipos tRNA/COI, sugerem que não há grande divergência genética entre os grupos propostos, de forma que a população de
M. capixaba pode estar compartilhando o mesmo pool gênico. Resultado
similar foi relatado por Nogueira (2009) que também obteve maior variação dentro do que entre grupos ao analisar M. capixaba por ISSR.
O aumento da variabilidade haplotípica tRNA/COI dentro dos grupos propostos para M. capixaba, (de 59,28 % para 64,06 %) sugere que o transporte de colônias pode estar contribuindo para o aumento do fluxo gênico e, consequentemente, diminuição de endogamia. Outra vantagem de se ter uma distribuição ampla dos haplótipos na região de ocorrência, principlamente em áreas fragmentadas, é a possibilidade de que o haplótipo não vá desaparecer com apenas um evento catastrófico, como por exemplo, a degradação de uma região pelo fogo.
Os valores ST estimados por PCR-RFLP da região tRNA/COI de M.
capixaba foram acima de 0,25 (0,41 e 0,36 antes e depois do transporte de
colônias, respectivamente), sugerindo alta estruturação da população de M.
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também foi relatado por Nogueira (2009) ( ST 0,28) ao analisar, por ISSR, 95 amostras (uma por colônia) de M. capixaba procedentes de 25 localidades da região serrana do Estado do Espírito Santo.
Ao avaliar os valores ST obtidos para M. capixaba é importante considerar o comportamento biológico desta abelha. Rainhas fecundadas de abelhas sem ferrão possuem o abdome altamente desenvolvido o que as impedem de voar, dificultando a migração entre os grupos. Além disso, as abelhas operárias não voam muito longe por dependerem de uma orientação para retornarem ao ninho e as rainhas virgens de meliponíneos, geralmente, fundam ninho próximo à matriz e mantêm ligação com esta por um determinado tempo. Já os machos voam sem rumo e a distâncias maiores sem a “preocupação” de retornarem para a colônia (Campos, 2009 - comunicação pessoal). Nesse modelo de estruturação, em que cada grupo de colônias troca migrante somente com o grupo vizinho (modelo passo a passo – Wright, 1978), um haplótipo recém surgido é disperso na região por etapas (de geração em